一種含硫橋復雜環系生物堿類化合物及其制備方法和用圖
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及用一株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研究所，100101保藏編號：CGMCC9429保藏日期：2014年7月9日）生產一種含硫橋復 雜環系生物堿類化合物的方法；本發明還涉及該化合物在抗腫瘤方面的用途。
【背景技術】：
[0002] 本發明人從菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏編號是：CGMCC9429)液 體發酵產物中分離出一種含硫橋復雜環系生物堿類化合物。研究發現所示化合物具有抗腫 瘤活性，目前尚未見該化合物的化學結構及細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未 見有與此有關的藥物。
【發明內容】
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[0003] 本發明旨在提供一種結構新穎的具有抗腫瘤活性的新化合物。其結構式是
[0004]
[0005]式I
【具體實施方式】 [0006] ：
[0007] 其結構特征是：式I是由一個比較罕見的氮氧雜環耦合一個六元環以及一個二酮 哌嗪環組成的結構復雜且新穎的結構，除此之外，還含有一個二硫橋和氯原子，豐富了式I 的復雜度。
[0008] 本發明的式I化合物可通過微生物發酵培養來獲取含有該類化合物的發酵物，然 后從發酵物中采用S印hadexLH20凝膠柱層析，中壓MPLC，半制備HPLC等方法分離純化 得到。本發明的下述實施例中列舉了利用青霉Penicilliumsp.HDN13-309(保藏編號是： CGMCC9429)制備本發明式I化合物的實例。
[0009] 在如下的實施例中所指的化合物I的化學結構（結構式中的阿拉伯數字是化學結 構中碳原子的標位）是：
[0010]
[0011] 式I
[0012] 化合物I
[0013] 實施例1化合物I的發酵生產及分離精制
[0014] 1發酵生產
[0015] 生產菌的發酵培養：按培養微生物的常規方法，取菌株青霉Penicillium sp.HDN13-309 (保藏編號是：CGMCC9429)適量，接種到PDA固體斜面培養基上，在28攝氏 度培養箱中培養5天。
[0016] 取斜面培養5天的菌株青霉Penicilliumsp.HDN13-309適量，接種到裝有300mL 培養基[培養基組成（克/升）：麥芽糖20. 0,葡萄糖10. 0,甘露醇20. 0,味精10. 0,酵母 膏3.0，玉米漿1.0，腿2?040 . 5，]\%504.71120 0.3，口11調節至6.5]的 10001^錐型瓶中，在28 攝氏度條件下靜置培養30天，獲得發酵產物。
[0017] 2浸膏的獲得 用紗布將發酵液和菌絲體分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至無丙酮，所得水 相用等量乙酸乙酯萃取三次。發酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯相，減壓 濃縮，得粗浸膏，共8克。 3化合物的分離精制 浸膏（8克）用甲醇溶解后，以二氯甲烷和甲醇為洗脫劑進行正相硅膠分離，分為6個 組分，然后組分4以甲醇為溶劑進行LH20柱層析，分為5個流份。組分5先以C-180DS中 壓柱層析，以甲醇-水為溶劑進行梯度洗脫，又分為10個組分，最后組分8經反相半制備高 效液相色譜（甲醇：水=55 : 45)得化合物I(20mg)。 化合物I白色固體，分子式C21H21N20sC1S2,HR-ESI-MSm/z:551.0335[M+Na]+，計算值 551. 0326。IR(KBr)unax3510,1660,1625,1606,1445,1384,1098,1030,709,670,652cm工。 蟲和13C-NMR數據見表1。
[0018]表 1 化合物I(ind6-DMS0)的1H和13CNMR數據（500 和 125MHz)a
[0019]
[0020]
[0021] a)本表信號歸屬基于DEPT、HMQC及HMBC圖譜解析結果。碳信號的多重度利用 DEPT方法確定并分別用s(單重峰）、d(二重峰）、t(三重峰）和q(四重峰）表示。
[0022] 實施例2化合物的抗腫瘤活性測試
[0023] 1實驗樣品及實驗方法
[0024] 被測樣品溶液的配制測試樣品為上述實施例1中分離精制的化合物I純品。精密 稱取適量樣品，用DMS0配制成所需濃度的溶液，供測活性。
[0025] SRB法：取對數生長期的Hela、HCT116、H0-8910和MGC803細胞用新鮮的 RPMI-1640培養基配制成密度為每毫升2X105個細胞的細胞懸液，按每孔200微升接種于 96孔板中，每孔加入2yL不同濃度的樣品或空白溶液，37°C下培養72小時。取藥物作用下 培養后的細胞，首先在光學顯微鏡下觀察藥物處理引起的形態學變化，判斷有無細胞周期 抑制，細胞凋亡或細胞壞死的形態學特征。每孔細胞中加入80 %三氯醋酸50yL，置于4°C 固定1小時，用水沖洗5次并空氣干燥。每孔加入0. 4%SRB的醋酸溶液50yL并在室溫靜 置30分鐘。用1 %醋酸水清洗4次，除去未結合的游離SRB染料。每孔加入150yLTris 緩沖液（10mm〇l/L，pH10. 5)溶解蛋白結合染料并利用MD公司產SPECTRAMAXPlus型酶標 儀測定每孔在520nm處的光密度（0D)值。在同一塊96孔板中樣品的每個濃度均設置三 孔，另設三孔空白對照和無細胞調零孔（如果藥物有顏色要做相應藥物濃度無細胞調零）。 各孔0D值先做相應無細胞調零，再取三孔平均0D值按IR% = (0D空自對-0D樣) /0D空白對 X100%式計算每個濃度下的細胞增殖抑制率（IR% )，并采用bliss法計算出半數抑制率IC50〇
[0026] MTT法：取對數生長期的HL-60和K562腫瘤細胞，將細胞密度調至每毫升2X105 個細胞，按每孔200yL加到96孔細胞培養板中，于37°C通入5%0)2的培養箱中培養4h。 樣品分別設定5個濃度梯度，每個濃度設3個平行樣，同時設陽性、陰性對照，每孔加樣品液 或空白液各2yL，培養72h，然后每孔加MTT液10yL，繼續培養4小時，37°C、2000轉/分 鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMS0各100yL，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結晶 完全溶解后，酶標儀測定每孔570nm處的吸光值（0D值）。取三孔平均0D值按IR% =(0D 空白對照-0D樣品）/0D空白對照X100%式計算樣品對細胞增殖的抑制率（IR%)，并采用bliss法 計算出半數抑制率IC5。。
[0027] 2實驗結果
[0028] 表2化合物I對多種腫瘤細胞的體外細胞毒活性
[0029]
[0030] 3結論
[0031] 化合物I對HCT116具有較好的抗腫瘤活性，并對多種腫瘤細胞模型均有抑制活 性，這為開發新型抗癌藥提供了化合物基礎。
【主權項】
1. 化合物結構如下式所示化合物I2. 權利要求1所述化合物的制備方法，其特征是發酵培養青霉Penici11ium sp.HDN13-309(保藏編號是：CGMCC9429)獲取含有上述化合物的發酵物，然后從發酵物中 分離純化出該類化合物。3. 權利要求2所述的制備方法，其中將所述發酵物經SephadexLH20凝膠柱層析，甲醇 為溶劑，再經反相中壓MPLC及反相半制備HPLC分離純化得該類化合物。4. 權利要求1所述化合物在抗腫瘤方面的用途。
【專利摘要】本發明涉及一種含硫橋復雜環系生物堿類化合物及其制備方法和用途。本發明從菌株青霉Penicillium？sp.HDN13-309中生產出一種新的含硫橋復雜環系生物堿類化合物。經實驗證實，該類化合物可作為細胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。CGMCC 942920140709
【IPC分類】C12R1/80, C12P17/18, A61P35/00, C07D513/22
【公開號】CN105037397
【申請號】CN201510063692
【發明人】李德海, 朱美林, 李靜, 顧謙群, 朱天驕, 車茜
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年2月5日