一種適合rapd分析的金線蓮dna提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種適合RAPD分析的金線蓮DNA提取方法。
【背景技術】
[0002]DNA的提取質量是分子生物學實驗的關鍵，直接影響后續實驗的準確性和重復性。目前國內已有多種DNA提取方法，其中最為常見且使用的是CTAB法和SDS法，由于不同植物的成分和代謝產物存在較大差異，根據不同的植物特點選擇最適合的提取方法十分關鍵。金線蓮由于其含有大量的多糖和多酚類物質，但其植物蛋白含量不高。SDS方法的特點在于其去除蛋白的能力，而對于多糖、多酚的去除方面不如CTAB法。本發明基于傳統的CTAB提取法進行改良，根據金線蓮的植物特點，得到最適合金線蓮RAPD分析的高純度DNA。
[0003]RAPD (random amplified polymorphic DNA)隨機擴增多態性 DNA，是以 PCR 為基礎，以10堿基隨機引物擴增基因組DNA，從而產生多態性DNA片段。由于其操作簡單，成本低的特點，廣泛用于植物種質資源的鑒定。由于RAro很不穩定，外界條件的變化很容易影響實驗結果。因此開發一種適合RAPD的高純度金線蓮DNA提取方法尤為重要，為今后利用RAH)分子標記技術分析金線蓮遺傳多樣性、種質鑒定、遺傳連鎖圖譜及親緣關系分析等方面研究提供了科學依據。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種適合金線蓮植物RAPD分析的高純度、高得率的DNA提取方法，為今后利用RAPD分子標記技術分析金線蓮遺傳多樣性、種質鑒定、遺傳連鎖圖譜及親緣關系分析等方面研究提供了科學依據。
[0005]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
本發明的目的可通過以下步驟來實現:
(1)取樣品0.4-0.6g，加液氮研磨后，倒入2mL離心管中，加入CTAB溶液；使用前加2%β -巰基乙醇，震蕩，放65°C水浴45分鐘，中途每隔5分鐘輕微顛倒數次，在20°C下12000轉離心15min ；
(2)取上清液，加入2/3體積的氯仿:異戊醇，平躺靜置5min，再在20°C下12000轉離心10分鐘；
(3)取上清液，加入1/3體積氯仿，平躺靜置5min，在20°C下12000轉離心10分鐘；
(4)取上清液，加等體積-20°C預冷的異丙醇，加1/5上清液體積pH5.2、3 mol/LNaAc，在_20°C冰箱放置30min，在4°C下12000轉離心15min，使DNA沉淀；
(5)去除上清液，用75%乙醇洗滌沉淀三次，用無水乙醇洗滌一次，晾干，加入25uL水使沉淀溶解；
(6)加入500uL高鹽TE，離心后取上清液，重復(2)至(5)步驟；
(7)加入IuL RNase A放置在37°C水浴30min，放入_20°C冰箱備用。
[0006]所述CTAB 溶液中包含 3wt.%CTAB，pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0、20mmol/L EDTA，2.0 mol/L NaCl，4wt.%PVP(K-30)。
[0007]所述的氯仿:異戊醇體積比為24:1。
[0008]所述高鹽TE 中包含 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20 mmol/LEDTA, pH 8.0 ；1.4mol/L NaCl0
[0009]本發明的優點在于:
(I)在傳統CTAB提取液中，提高PVP使用量至4%，提高鹽濃度至2.0moI/L0金線蓮中富含分類化合物，這些酚類化合物氧化后易與DNA共價結合，使DNA褐變，并能抑制DNA酶解反應，在DNA提取過程中加入一定量的PVP能防止植物細胞中的酚類物質氧化，而在金線蓮DNA提取過程中，適當提高PVP的使用量能夠有效地提高0D260/230的值，即提高DNA的純度。經實驗表明，PVP添加量在4%時0D260/230值最高，效果最好。高鹽環境可以提高DNA在水中的溶解度且不破壞其結構，適當提高鹽濃度有助于DNA在異丙醇中沉淀，從而提高得率，而金線蓮中富含的多糖類化合物結構與DNA十分相似，不易去除，而適當提高提取液的鹽濃度可以促進多糖化合物的分離，從而提高所提DNA的純度。
[0010](2)使用氯仿:異戊醇(24:1) —方面節約了成本，一方面可減少有毒藥品的使用，且不用擔心跡量酚影響DNA純度。實驗結果證明，使用改良的方法后0D260/280值仍在1.7至1.9之間，說明氯仿:異戊醇(24:1)能完全去除DNA中的少量蛋白質。
[0011](3)在異丙醇沉淀 DNA 后加入 500uL 高鹽 TE(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20mmol/LEDTA，pH 8.0 ；1.4 mol/L NaCl)重沉淀，這一步雖然會減少DNA的得率，但2次沉淀能夠有效地提高0D260/230值，提高所提DNA的純度。
[0012](4)最后加入RNaseA會導致0D260/230值的下降，但這主要是由于其中甘油的影響，而甘油作為保存劑不影響后續的分子實驗，無需考慮去除。有的傳統方法是在沉淀前加入RNaseA,但這依然不能避免0D260/230值的降低，反而容易降解部分DNA，影響得率。使用改良后的方法提取的金線蓮DNA在后續RAPD實驗中，條帶清晰、明亮、穩定、重復性高。
【附圖說明】
[0013]圖1 DNA樣品的電泳檢測結果。
[0014]圖2 DNA樣品的電泳檢測結果。
[0015]圖3 CTAB4法提取DNA的RAI3D擴增結果(20個不同種質資源金線蓮的RAPD圖譜，包括1.福建鈍尖葉、2.福建紅葉、3.福建紅霞、4.福建大圓葉、5.福建小葉、6.福建大青桿、7.福建小圓葉、8.福建絨葉(細一線)、9.福建絨葉(粗一線)10.福建絨葉(無線)11.福建小葉變種、12.廣東大黑葉、13.廣東大葉A、14.廣東大葉變種、15.廣東大葉B、16.福建紅霞小葉、17廣西尖葉、18.云南品種、19.臺灣品種、20.福建大紅葉)。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
(I)適量樣品(0.5g)，加液氮研磨后，倒入2mL離心管中，加入CTAB溶液(3%CTAB ;100mmol/L Tris-HCLpH 8.0 ；20 mmol/LEDTA，pH 8.0 ；2.0 mol/L NaCl ；4%PVP (K-30);使用前加2% β -巰基乙醇，震蕩，放65°C水浴45分鐘，中途每隔5分鐘輕微顛倒數次，在20°C下12000 轉離心 15min。
[0017](2)取上清液，加入2/3體積的氯仿:異戊醇(體積比為24:1)，平躺靜置5min，再在20。。下12000轉離心10分鐘。
[0018](3)取上清液，加入1/3體積氯仿，平躺靜置5min，在20°C下12000轉離心10分鐘。
[0019](4)取上清液，加等體積-20°C預冷的異丙醇，加1/5上清液體積3mol/L NaAc (pH 5.2)，在_20°C冰箱放置30min，在4°C下12000轉離心15min，使DNA沉淀。
[0020](5)去除上清液，用75%乙醇洗滌沉淀三次，用無水乙醇洗滌一次，晾干，加入25uL水使沉淀溶解。
[0021](6)加入 500 uL 高鹽 TE(100 mmol/L Tris-HCLpH 8.0 ；20 mmol/LEDTA,pH 8.0 ；1.4 mol/L NaCl)，重復(2)至(5)步驟。
[0022](7)加入I uL RNase A放置在37°C水浴30min。放入_20°C冰箱備用。
[0023]檢測DNA質量的方法主要是電泳檢測及分光光度計的檢測。電泳檢測結果中的條帶必須達到清晰、明亮、無拖帶。在分光光度計檢測中，核酸在260nm處有吸收峰，0D260/280值必須在1.7至1.9之間，如所提DNA由蛋白質殘留，其值將小于1.7，若DNA中有RNA殘留，其值將大于1.9。0D260/230值必須大于1.8，若DNA中有多糖、多酚、酒精等雜質殘留，將使0D260/230值降低。
[0024]采用本發明所述方法提取的金線蓮DNA，如圖1所示，經過電泳檢測，得到清晰，明亮的條帶。如圖2所示，經微量分光廣度計檢測，其濃度為785.4ng/uL，0D260/280=1.84，0D260/230=1.96。如圖3所示，用本發明方法提取的金線蓮DNA應用于RAPD分析，所得的RAro條帶清晰、整齊、穩定、無拖帶現象，說明本實驗建立的方法切實可行。
[0025]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種適合RAPD分析的金線蓮DNA提取方法，其特征在于該方法包括下列步驟: (1)取樣品0.4-0.6g，加液氮研磨后，倒入2mL離心管中，加入CTAB溶液1.5mL ;使用前加2wt.% β-巰基乙醇，震蕩，放65°C水浴45分鐘，中途每隔5分鐘輕微顛倒數次，在20°C下12000轉離心15min ； (2)取上清液，加入2/3體積的氯仿:異戊醇，平躺靜置5min，再在20°C下12000轉離心10分鐘； (3)取上清液，加入1/3體積氯仿，平躺靜置5min，在20°C下12000轉離心10分鐘； (4)取上清液，加等體積-20°C預冷的異丙醇，加1/5上清液體積pH5.2、3 mol/LNaAc，在_20°C冰箱放置30min，在4°C下12000轉離心15min，使DNA沉淀； (5)去除上清液，用75%乙醇洗滌沉淀三次，用無水乙醇洗滌一次，晾干，加入25uL水使沉淀溶解； (6)加入500uL高鹽TE，離心后取上清液，重復(2)至(5)步驟； (7)加入IuL RNase A放置在37°C水浴30min，放入_20°C冰箱備用。2.根據權利要求1所述的一種適合RAPD分析的金線蓮DNA提取方法，其特征在于:所述 CTAB 溶液中含 3wt.%CTAB，pH 8.0、100 mmol/L Tris-HCLpH 8.0、20 mmol/L EDTA, 2.0mol/L NaCl，4wt.%PVP(K-30)。3.根據權利要求1所述的一種適合RAPD分析的金線蓮DNA提取方法，其特征在于:所述的氯仿:異戊醇體積比為24:1。4.根據權利要求1所述的一種適合RAPD分析的金線蓮DNA提取方法，其特征在于:所述高鹽 TE 中含 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0 ；20 mmol/LEDTA, pH 8.0 ；1.4 mol/L NaCl。
【專利摘要】本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種適合RAPD分析的金線蓮DNA提取方法。本發明根據金線蓮的植物特點，從而得到高純度、高得率的金線蓮DNA。本發明主要包括以下4個方面優點。（1）在傳統CTAB提取液中，提高PVP使用量至4%，提高鹽濃度至2.0mol/L。（2）使用氯仿：異戊醇（24:1）（3）在異丙醇沉淀DNA后加入500uL高鹽TE(100mmo1/L？Tris-HC1，pH8.0；20mmo1/LEDTA，pH8.0；1.4mol/L？NaCl)重沉淀。（4）最后加入RNaseA。使用本發明方法提取的金線蓮DNA在后續RAPD實驗中，條帶清晰、明亮、穩定、重復性高。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105018467
【申請號】CN201510421526
【發明人】張重義, 王劍鍇, 李明杰, 王建明, 馮法節, 張寶
【申請人】福建農林大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月17日