培養人胎盤間充質干細胞的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物科學技術領域，尤其是一種培養人胎盤間充質干細胞的方法。
【背景技術】
[0002]干細胞是一種未分化的細胞，有西個基本特性，一是具有白我復制能力，二是能分化成一種以上的功能細胞，根據分化潛能的大小，干細胞一般分成三類，第一類是全能干細胞(totipotent stem cell),其可以分化為功能一致的全能細胞，可以發育為月臺兒，第二類是多潛能干細胞(pturipotent stem cel)，它能夠分化為身體中的每種細胞類型，但是不能形成月臺盤或胎兒發育所必需的支持組織。由于多潛能干細胞的分化港能不是“全體”的，因此不將這種細胞稱為“全能”，而且它們不是胚_胎。多潛能干細胞進一步特化為多能(mult iPotent)干細胞，其專用于分化為特定功能特化的特定種系的細胞。多能干細胞能夠分化為它們所源自的組織中含有的細胞類型；例如血液干細胞只能夠分化為紅血細胞、白血細胞和血小板。胚月臺干細胞(Embryonic stem cell)具有廣泛的潛能，能生成除胎盤外的機體所有的組織細胞；第三類是成體干細胞(aduit stemcell)是一種將tF目有終生白我復制(identical copies)和白我更新(self-renewal)能力的未分化細胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類型的資質細胞。干細胞的分類，主要分為造血干細胞及非造血干細胞。造血干細胞主導_[?1^液、免疫方面的疾病，來源例如臍帶血；非造血干細胞則以細胞分化與修復為主，可應用于中風、糖尿病、老年癡呆等再生醫學，來源有所帶、胎盤。
[0003]間充質干細胞(mesenchymal stem cell MSC)是可形成多種細胞類型的多能干細胞。間充質干細胞(MSC)最早在骨髓中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。鑒于間充質干細胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進造血干細胞植入、調節免疫以及分高培養操作簡使等特點，正日益受到人們的關注。間充質干細胞的應用范國也越來越廣泛。日前國內外已開展了多項臨床應用研究，主要疾病類型包括骨關節炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應(GvHD)，脊髓損傷及退行性神經系統疾病和糖尿病等。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是:提供一種培養人胎盤間充質干細胞的方法，它解決了現有技術存在的易污染、產量低、培養效果差等技術難題。
[0005]本發明是這樣實現的:培養人胎盤間充質干細胞的方法，包括如下步驟:
1)使用無菌止血鉗剝除胎膜的羊膜層，將胎盤蛻膜部分剪下，放入新的培養皿中，用生理鹽水洗滌3次；
2)將剪取剝離好的胎盤蛻膜放入離心管中，每1ml加入含有1ul頭孢哌酮鈉注射液及兩性霉素b抗生素的基礎培養液作為組織備份；從胎盤上分離的胎盤蛻膜組織，置于含1ml生理鹽水的培養皿中；
3)將上述分離下來的組織胎盤蛻膜組織收集于離心管中，加入45ml生理鹽水于50ml離心管中，離心500g/5min，洗滌1_2遍，棄上清，剪碎成I?4mm3大小的組織塊；
4)向剪碎的組織塊中加入膠原酶II，剪碎的組織塊與膠原酶的體積比為1:3 ;充分混勻后，置于恒溫振蕩器中，溫度為37°C，轉速為150rpm，時間為Ih ;
5)在反應完成后，加入消化體積3-5倍的生理鹽水，充分混勻；將消化后的混合液立刻過濾，并將組織塊洗滌1-2次；細胞濾液300g/10min離心，用移液管吸取去掉上清；加入1ml完全培養基，其中含1ul頭孢哌酮鈉及兩性霉素b，吹打后轉入培養瓶:
6)壁蛻膜組織按每ImL組織塊對應接種I個T75細胞培養瓶，將細胞接種到3個T-75培養瓶中，每瓶含有1mL含抗生素的培養液，其中含1ul頭孢哌酮鈉及兩性霉素b ;將培養瓶水平放入37°C，質量百分比為5%的CO2培養箱中進行原代培養；
7)原代培養24-48h后，進行第一次全量換液，此后每隔3天全量換液一次，放置在培養箱中進行培養；
8)原代培養7-14天后，在原代培養的細胞融合度達到80-90%時，消化收獲；收集培養基900g，并進行5min離心；用10-20 mL的生理鹽水清洗T-75培養瓶I次；加入質量百分比為0.125%的復溫胰酶3mL ;在顯微鏡下觀察，直至有80%的細胞變圓脫落漂浮，即用離心后的培養基上清終止消化，消化過程在室溫條件下進行4-6min ;
9)將細胞懸液收集到一個50mL離心管中；用10-20mL的生理鹽水清洗T-75培養瓶，洗液也收集到該50mL離心管中；用100 μ m細胞過濾器過濾后，300g離心lOmin，去上清，加生理鹽水吹勻細胞，定容至20mL混勻，取0.5mL細胞懸液進行計數，其余細胞懸液離心300g/10min ；
10)如果Pl活細胞總數低于1.5xl07，則按上述方法再傳代一次；其中活細胞總數包括凍存細胞總數及流式送檢數；
11)收集最后離心洗滌上清液，送檢需氧菌及真菌、厭氧菌及真菌檢測；用適量完全培養基重懸細胞團塊，并混合均勻。
[0006]由于采用了以上技術方案，本發明對人胎盤間充質干細胞的培養方法進行優化，采用該方案來培養人胎盤間充質干細胞所獲得的產品不易污染，而且產量高，培養成本低。本發明簡單易行，成本低廉，使用效果好。
【附圖說明】
[0007]圖1流式細胞檢測儀檢測胎盤表面標志物。
【具體實施方式】
[0008]本發明的實施例:培養人胎盤間充質干細胞的方法，包括如下步驟:
7)原代培養24_48h后，進行第一次全量換液，此后每隔3天全量換液一次，放置在培養箱中進行培養；
8)原代培養7-14天后，在原代培養的細胞融合度達到80-90%時，消化收獲；收集培養基900g，并進行5min離心；用10-20 mL的生理鹽水清洗T-75培養瓶I次；加入質量百分比為0.125%的復溫胰酶3mL ;在顯微鏡下觀察，直至有80%的細胞變圓脫落漂浮，即用離心后的培養基上清終止消化，消化過程在室溫條件下進行4-6min ;
9)將細胞懸液收集到一個50mL離心管中；用10-20mL的生理鹽水清洗T-75培養瓶，洗液也收集到該50mL離心管中；用100 μ m細胞過濾器過濾后，300g離心lOmin，去上清，加生理鹽水吹勻細胞，定容至20mL混勻，取0.5mL細胞懸液進行計數，其余細胞懸液離心300g/10min ；
10)如果Pl活細胞總數低于1.5xl07，則按上述方法再傳代一次；其中活細胞總數包括凍存細胞總數及流式送檢數；
11)收集最后離心洗滌上清液，送檢需氧菌及真菌、厭氧菌及真菌檢測；用適量完全培養基重懸細胞團塊，并混合均勻。
[0009]經流式細胞術檢測，人胎盤MSCS強表達透明質酸受體⑶44和整合素家族成員CD29,陽性率分別為99.8%, 99.7%;不表達造血干細胞標志CD34 (4.8%)、CD45 (0.9%)、⑶14 (1.16%)，也不表達內皮細胞標志⑶106 (2.3%);值得注意的是，人胎盤MSCS不表達與移植物抗宿主病(Graft-versus-hostdisease, GVHD)有關的 HLA-DR(1.0%)和CD40(0.96%)，如圖1 所示 ο
[0010]本發明所述并不限于【具體實施方式】中所述的實施例，本領域技術人員根據本發明的技術方案得出其他的實施方式，同樣屬于本發明的技術創新范圍。顯然本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術范圍內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。
【主權項】
1.一種培養人胎盤間充質干細胞的方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)使用無菌止血鉗剝除胎膜的羊膜層，將胎盤蛻膜部分剪下，放入新的培養皿中，用生理鹽水洗滌3次； 2)將剪取剝離好的胎盤蛻膜放入離心管中，每1ml加入含有1ul頭孢哌酮鈉注射液及兩性霉素b抗生素的基礎培養液作為組織備份；從胎盤上分離的胎盤蛻膜組織，置于含1ml生理鹽水的培養皿中； 3)將上述分離下來的組織胎盤蛻膜組織收集于離心管中，加入45ml生理鹽水于50ml離心管中，離心500g/5min，洗滌1_2遍，棄上清，剪碎成I?4mm3大小的組織塊； 4)向剪碎的組織塊中加入膠原酶II，剪碎的組織塊與膠原酶的體積比為1:3 ;充分混勻后，置于恒溫振蕩器中，溫度為37°C，轉速為150rpm，時間為Ih ; 5)在反應完成后，加入消化體積3-5倍的生理鹽水，充分混勻；將消化后的混合液立刻過濾，并將組織塊洗滌1-2次；細胞濾液300g/10min離心，用移液管吸取去掉上清；加入1ml完全培養基，其中含1ul頭孢哌酮鈉及兩性霉素b，吹打后轉入培養瓶: 6)壁蛻膜組織按每ImL組織塊對應接種I個T75細胞培養瓶，將細胞接種到3個T-75培養瓶中，每瓶含有1mL含抗生素的培養液，其中含1ul頭孢哌酮鈉及兩性霉素b ;將培養瓶水平放入37°C，質量百分比為5%的CO2培養箱中進行原代培養； 7)原代培養24-48h后，進行第一次全量換液，此后每隔3天全量換液一次，放置在培養箱中進行培養； 8)原代培養7-14天后，在原代培養的細胞融合度達到80-90%時，消化收獲；收集培養基900g，并進行5min離心；用10-20 mL的生理鹽水清洗T-75培養瓶I次；加入質量百分比為0.125%的復溫胰酶3mL ;在顯微鏡下觀察，直至有80%的細胞變圓脫落漂浮，即用離心后的培養基上清終止消化，消化過程在室溫條件下進行4-6min ; 9)將細胞懸液收集到一個50mL離心管中；用10-20mL的生理鹽水清洗T-75培養瓶，洗液也收集到該50mL離心管中；用100 μ m細胞過濾器過濾后，300g離心lOmin，去上清，加生理鹽水吹勻細胞，定容至20mL混勻，取0.5mL細胞懸液進行計數，其余細胞懸液離心300g/10min ； 10)如果Pl活細胞總數低于1.5xl07，則按上述方法再傳代一次；其中活細胞總數包括凍存細胞總數及流式送檢數； 11)收集最后離心洗滌上清液，送檢需氧菌及真菌、厭氧菌及真菌檢測；用適量完全培養基重懸細胞團塊，并混合均勻。
【專利摘要】本發明提供了一種培養人胎盤間充質干細胞的方法。本發明對人胎盤間充質干細胞的培養方法進行優化，采用該方案來培養人胎盤間充質干細胞所獲得的產品不易污染，而且產量高，培養成本低。本發明簡單易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號】CN105018421
【申請號】CN201510277006
【發明人】邊曙光
【申請人】貴州北科泛特爾生物科技有限公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年5月27日