一種檢測肝癌標志物ezh2抗原表位氨基酸序列及應用
【專利說明】
[0001]
技術領域
[0002] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種通過生物信息學模擬篩選的具有檢測肝 癌標志物EZH2多肽片段。
【背景技術】
[0003] 肝癌是目前我國發病率和致死率位居第二位的惡性腫瘤，每年約有30萬例新發 肝癌，占全球50%以上。肝癌發展迅速、易轉移，是目前治療最困難、預后最差的惡性腫瘤之 一。然而，相對于乳腺癌、肺癌和前列腺癌等其他類型的惡性腫瘤，至今仍缺乏對肝癌發病 相關腫瘤標志物分子認識。大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關抗原能誘導機體產生 自身抗體，在腫瘤患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針對該腫瘤抗原的自身抗體。因此， 既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測腫瘤抗原的自身抗體，但利用腫瘤自 身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關抗 原不僅在腫瘤患者體內存在，在正常人體內也存在，因此檢測腫瘤相關抗原作為診斷依據 可信性差。而腫瘤自身抗體在正常人體內含量很低檢測不到或根本不存在，若體內腫瘤自 身抗體水平明顯增高，則表明體內存在異常免疫情況，表明體內相關抗原水平發生波動，預 示疾病的存在或原有疾病加重。
[0004] 近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發展到可用現代影像學技術檢出之前3-5 年，患者血中可出現高濃度的腫瘤相關抗原自身抗體。因此，檢測血中腫瘤相關抗原自身抗 體具有預測腫瘤發病風險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領域的重點發展方 向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的自身 抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50%以上。其主要原因是由于每一種 腫瘤相關抗原自身抗體在癌癥患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏 感度是當前需要亟待解決的關鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當腫瘤標志物 的自身抗體，然后與現有已知的腫瘤相關抗原自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強的 診斷試劑盒。
[0005] EZH2屬于PcG家族成員，是1996年被發現的一種人轉錄調節蛋白，通過甲基化核 小體組蛋白H3的9、27位賴氨酸殘基來沉默下游基因。EZH2在肝癌、乳腺癌、前列腺癌和胃 癌等惡性腫瘤中呈高表達，與腫瘤的轉移和不良預后有關，是腫瘤治療的新靶點。EZH2作為 PcG蛋白的核心成分，在腫瘤的發生、發展中起到重要作用。①調控組蛋白甲基轉移酶和組 蛋白去酰化酶（HDAC)的活性；②誘導HDAC的活性，介導HDAC依賴性基因沉默：EZH2與EED 形成復合物與HDAC作用，EZH2的SET結構域催化H3-K27甲基化而抑制靶基因的表達，觸 發或維持染色體的轉錄抑制狀態，從而沉默靶基因導致腫瘤發生；③促進細胞增殖：EZH2 在增殖的外套淋巴細胞瘤細胞中高表達，而在靜止的細胞中則不表達或弱表達。基于EZH2 在腫瘤組織和正常組織間表達的巨大差異和其在腫瘤發展中的重要作用，EZH2作為一個預 測、預后指標和抗癌治療靶點吸引了越來越多的關注。同時提示我們其在肝癌早期診斷的 應用價值較好，以及作為潛在生物標志物的可能。本發明通過自行設計的EZH2抗原表位多 肽，檢測腫瘤患者血清及血漿中自身抗體水平并開發相應的試劑，預測肝癌發生的危險性 及預后預測，并為肝癌新藥研究提供可靠的數據。
[0006] 本發明通過自行設計的EZH2抗原表位多肽，檢測肝癌患者血清及血漿中自身抗 體表達水平并開發相應的試劑，預測肝癌發生的危險性，并為制備肝癌早期診斷及預后預 測試劑盒奠定基礎。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是公開一種檢測肝癌標志物EZH2自身抗體的抗原表位 序列。
[0008] 本發明同時公開了 EZH2抗原表位的用途。
[0009] 本發明提供的一種檢測肝癌標志物EZH2自身抗體的抗原表位氨基酸序列為： H-DHRDDKESRPPRKFPCGEIISQDEADRRGKV-OH 其純度 >95%，pH>7. 0。
[0010] 本發明所述的EZH2抗原表位多肽在制備肝癌早期診斷試劑盒中的應用。
[0011] 本發明利用自行設計的EZH2蛋白的線性多肽，采用ELISA法檢測肝癌患者血清 及血漿中抗EZH2蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤患者體內 EZH2蛋白的表達量增加，預示患者可能出現原發性或繼發性肝癌，可以預測肝癌發生與復 發的危險性，指導臨床醫生對肝癌的早期診斷及預后預測。
[0012]
抗原抗體的結合實際上只發生在抗原決定簇和抗體的抗原結合位點之間，兩者在空間 結構和空間構型上完全互補。因此抗原決定簇就可以代表整個蛋白與抗體結合的狀態與親 和特性。另外，以重組蛋白為抗原，要經過載體構建、轉染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程， 蛋白空間結構復雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結合的特異性差。此外，ELISA法的 高靈敏性對純化技術的穩定性要求極高，成本昂貴。
[0013] 發明人遵循以下原則設計線性多肽抗原：①選擇細胞膜蛋白表面區域；②選擇不 形成a-helix的序列；③兩端的肽段比中間的排列合理；④避免蛋白內部重復；⑤避免同源 性強的肽段；⑥序列中盡量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2個Pro利于肽鏈 結構穩定，對產生特異性抗體有益。此外，該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原（HLA) 系統的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DP and HLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90% 以上華人群體的HLA二類抗原系統所識別。基于以上抗原設計原則及EZH2蛋白的生物學 特性，本發明利用生物信息學和多個表位預測模擬軟件，分析與抗原性相關的參數，設計了 的線性氨基酸序列。EZH2線性多肽抗原由31個氨基酸殘基組成，共含10個重疊表位，可檢 測至少10種單克隆抗體，具有高度的特異性。
[0014] 法檢測抗原表位 我們采用ELISA方法，對收集的血液進行檢測，并得到各樣本OD值進行分析。
[0015] 質控各樣本設雙復孔，取平均OD值。OD值離散度判定：離散度=0D1-0D2/ 0D1+0D2,離散度< 0. 1，為有效結果；離散度>0. 1，為無效結果。取100份健康人血清等體 積混合作為質控血（Quality control, QC)，代表人群的普遍情況，每板均設2個QC血衆 孔，以QC血漿孔的OD值變異水平判定結果的穩定性，批間變異CV=所有批次QC孔SD/所 有批次QC孔OD均值〈20%。批內變異CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10%。
[0016] 數據分析采用SPSS17. 0 for windows進行統計學分析。采用特異結合指數 (Specific binding index，SBI)來判定EZH2抗原多肽與血衆自身抗體的結合程度，SBI= EZH2 OD值-NC OD值/ QC OD值-NC OD值，NC為各樣本的陰性對照。利用?檢驗分 別比較惡性肝癌組與健康對照之間SBI值之間的差異，a=0. 05。
[0017] ROC曲線是根據一系列不同的二分類方式(分界值或決定閾)，以真陽性率(靈敏 度）為縱坐標，假陽性率（1-特異度）為橫坐標繪制的曲線。ROC曲線下的面積值在I. 0和 0. 5之間。在AU>0. 5的情況下，AU越接近于1，說明診斷準確度越好。ROC曲線將靈敏度與 特異性以圖示方法結合在一起，可準確反映某分析方法特異性和敏感性的關系，是試驗準 確性的綜合代表。該發明采用Analyse-it for Microsoft Excel軟件繪制ROC曲線，計算 曲線下面積（AU )，判定靈敏度和特異度。
[0018] 本發明應用EZH2抗原表位多肽檢測到肝癌患者血清及血漿中的EZH2特異性自身 IgG抗體，并且該反應具有尚特異性和尚靈敏性。
[0019] EZH2抗原表位多肽可用于制備肝癌早期診斷及預后預測試劑盒。
【附圖說明】
[0020] 附圖為肝癌患者體抗EZH2自身IgG抗體水平的ROC曲線分析圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例子，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例子僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。
[0022] 實施例1 試劑盒制備 1試劑試劑配制見Tab. 2~7。
2操作 (I)包被：酶標板應用洗滌緩沖液清洗3遍，工作抗原用包被液稀釋至工作濃度，包被 于酶標板，4 °C過夜。
[0024] (2)加谷氨酸：洗滌緩沖液清洗3遍，用包被液稀釋谷氨酸至濃度lOOPg/ml，每孔 20〇μ1，37Γ或室溫孵育Ih ; (3) 加血漿和質控對照（一抗）：酶標板應用洗滌緩沖液清洗3遍，利用包被液將血漿 稀釋至合適濃度，一般為1:100~1:500,每孔10〇μ1，37°C或室溫孵育Ih ; (4) 二抗孵育：洗滌緩沖液清洗3遍，利用包被液稀釋二抗標準液IgG，工作濃度 1:20000,每孔加10〇μ1，37°C或室溫孵育Ih ; (5) 顯色：洗滌緩沖液清洗3遍，每孔加10〇μ1底物顯色液，室溫避光30~45min。
[0025] (6)檢測：每孔加5〇μ1終止液，IOmin內檢測，檢測波長為450nm，參考波長為 630nm〇
[0026] 實施例2 肝癌患者的EZH2自身IgG抗體檢測 1樣本收集：本研究從吉林大學第三醫院、省腫瘤醫院選取經放射學檢查和組織學檢 查確診肝癌樣本103例。所有血清樣本采集前未經過任何抗癌治療，并具有全面的臨床資 料和信息。同時招募了健康對照組樣本121例。臨床訪談及影像學檢查均排除肝癌患病可 能。健康組與肝癌組在性別、年齡匹配，具有可比性（/M). 05) 2檢測結果:EZH2的自身抗體表達水平（Tab. 8):肝癌組與健康對照組相比存在統計 學差異（?=4· 312,尸〈0· 001)。
[0027] ROC曲線分析：肝癌患者ΕΖΗ2自身IgG抗體檢測在ROC曲線下面積為0.723 (SE=0.0 35，95%CI :0· 579-0. 715)(附圖和 Tab. 9)。
[0028] 以上數據充分表明，利用本發明所設計的抗原表位多肽檢測得到的肝癌患者自身 抗體IgG水平與正常健康組比較有顯著性統計學差異。
[0029] 抗EZH2自身IgG抗體在肝癌患者和健康對照樣本中的表達水平
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【主權項】
1. 一種檢測肝癌標志物EZH2抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列為 H-DHRDDKESRPPRKFPCGEIISQDEADRRGKV-OH 其純度 >95%，pH>7. 0。2. 根據權利要求1所述的檢測肝癌標志物EZH2抗原表位多肽在制備肝癌早期診斷及 預后預測試劑盒中的應用。
【專利摘要】一種檢測肝癌標志物EZH2抗原表位的氨基酸序列及應用，屬于免疫學技術領域，本發明提供了一種肝癌相關基因EZH2的抗原氨基酸序列。應用EZH2多肽抗原檢測肝癌患者血中相應的特異性自身抗體，這種自身抗體可作為肝癌標志物評估肝癌發生的危險度及預后療效。這種抗原多肽及其抗體可用于制備肝癌早期診斷、預后預測試劑和開發治療肝癌的靶向藥物。
【IPC分類】G01N33/68, C07K14/47, G01N33/574
【公開號】CN105017404
【申請號】CN201510426291
【發明人】王雷, 王爽
【申請人】吉林省吉諾生物工程有限責任公司
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月20日