一種利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物化工領域，特別涉及一種利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方 法。
【背景技術】
[0002] 小球藻（Chlorella spp.)是一類普生性單細胞綠藻，屬于綠藻門 (Chlorophyta)，綠藻綱（Chloro-phyceae)，綠藻目（Chlorococcales)，卵囊藻科 (Oocys一taceae)，小球藻屬（Chlorellapyrenoidosa) t。小球藻體內含有豐富的生物活性 物質，如不飽和脂肪酸、色素、蛋白質等，具有抗腫瘤、抗菌和抗病毒，防治消化性潰瘍和缺 鐵性貧血、抗高脂血癥和動脈粥樣硬化、抗輻射、解毒保肝和降低血壓等多種功能。通常蛋 白質含量較高（55% -67% )，其次是糖類（15% -10% )，并含有具有生物活性的藻多糖、植 物生長因子、（ChlorellaGrowth Factors，CGF)、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纖維等。近年來的 研究發現，人類攝取蛋白質經消化酶作用后，并非主要以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形 式吸收。目前已有從螺旋藻和其他微藻蛋白的水解物中成功提取具有生理活性的多肽的報 道，但對富含蛋白質的小球藻加工制備生物活性多肽的工藝相關的報道還較少。已知的研 究只有利用酶解法制備小球藻生物多肽的研究（鐘秋平，林美芳，戴梓茹等.酶解小球藻 蛋白制備多肽的工藝研究[J].食品研究與開發，2014, 6(35) :53-55)，該研究發現利用酶 解法制備生物活性肽，不僅可以提高蛋白質的溶解性，降低小球藻中的不良腥味等負面影 響，而且營養成分缺失少。在該工藝中小球藻細胞壁是提取生物多肽最關鍵的一個因素，采 用超聲波破碎法，設備昂貴、增加生產成本，同時采用酶法提取，多肽富集液純度較低，因此 不適用于大規模工業應用。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是：對于上述現有技術的不足，提供一種利用小球藻 蛋白提取生物活性多肽的方法。
[0004] 本發明一種利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，其提取方法具體步驟如 下：
[0005] 1、破壁：配制濃度為8% -10%的小球藻混懸液，經_20°C冷凍，后室溫下解凍。重 復凍融過程4次，每次冷凍12h ;
[0006] 2、小球藻蛋白提取：將步驟1中凍融完成小球藻混懸液置于磁力攪拌儀2. 5h、后 低溫（-2°C )離心10min,轉速控制2000_2500r/min，取上清液；
[0007] 3、生物多肽提取：將步驟2中含有小球藻蛋白上清液配制200ml濃度為2g/L溶 液，調節PH為8. 5,置于泡沫分離器中，調節空氣流速為50ml/min、待泡沫產生開始計時 20min，后立即停止通氣，收集泡沫、冷凍（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0008] 進一步，步驟3中所述優選采用檸檬酸緩沖液調節pH為8. 5。
[0009] 泡沫分離技術是根據表面吸附的原理，通過向溶液通氣產生泡沫并形成泡沫層， 通過吹氣將泡沫層帶出容器，從而將泡沫層與液相主體分離。表面活性物質聚集在泡沫層 內，由于蛋白質和多肽都是表面活性物質，在通氣情況下容易產生泡沫并形成泡沫層通過 氣泡分離就可以達到濃縮表面活性物質目的。
[0010] 本發明的有益效果：本發明采用泡沫分離法與傳統酶法、超臨界萃取技術相比，設 備簡單，易操作，而且環保，提取得到的多肽液純度高，適用于工業化應用。同時經本發明的 方法小球藻蛋白生物活性多肽提取率范圍為16. 525% ±0. 2%。
【附圖說明】
[0011] 圖1為牛血清蛋白溶液標準曲線圖
【具體實施方式】
[0012] 實施例1
[0013] 1、破壁：稱取小球藻粉100g，配制為10%的小球藻混懸液，經_20°C低溫冷凍，后 室溫下解凍。重復凍融過程4次，每次冷凍12h ;
[0014] 2、小球藻蛋白提取：將步驟1中凍融完成小球藻混懸液置于磁力攪拌儀2. 5h、后 低溫（-2°C )離心10min,轉速控制2000r/min，取上清液；
[0015] 3、生物多肽提取：將步驟2中含有小球藻蛋白上清液配制成lg/L溶液，調節pH為 8. 5,置于泡沫分離器中，調節空氣流速為50ml/min、待泡沫產生開始計時20min，后立即停 止通氣，收集泡沫、低溫（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0016] 實施例2
[0017] 1、破壁：稱取小球藻粉50g，配制為8%的小球藻混懸液，經-20°C低溫冷凍，后室 溫下解凍。重復凍融過程4次，每次冷凍12h ;
[0018] 2、小球藻蛋白提取：將步驟1中凍融完成小球藻混懸液置于磁力攪拌儀2. 5h、后 低溫（-2°C )離心10min,轉速控制2000r/min，取上清液；
[0019] 3、生物多肽提取：將步驟2中含有小球藻蛋白上清液配制成lg/L溶液，調節pH為 8. 5,置于泡沫分離器中，調節空氣流速為50ml/min、待泡沫產生開始計時20min，后立即停 止通氣，收集泡沫、低溫（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0020] 實施例3
[0021] 1、破壁：稱取小球藻粉150g，配制為9%的小球藻混懸液，經_20°C低溫冷凍，后室 溫下解凍。重復凍融過程4次，每次冷凍12h ;
[0022] 2、小球藻蛋白提取：將步驟1中凍融完成小球藻混懸液置于磁力攪拌儀2. 5h、后 低溫（-2°C )離心10min,轉速控制2500r/min，取上清液；
[0023] 3、生物多肽提取：將步驟2中含有小球藻蛋白上清液配制成lg/L溶液，調節pH為 8. 5,置于泡沫分離器中，調節空氣流速為50ml/min、待泡沫產生開始計時20min，后立即停 止通氣，收集泡沫、低溫（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。
[0024] 對比例
[0025] -種利用酶解小球藻蛋白制備多肽的工藝，其制備工藝如下：小球藻粉一超聲波 破碎一加蛋白酶一滅酶活性一冷卻一離心一取上清液-測定多肽提取率
[0026] 試驗例
[0027] 分別采用實施例1、2、3及對比例的提取方法測定小球藻生物活性多肽提取率試 驗
[0028] 采用福林酚試劑法測定小球藻生物活性多肽提取率
[0029] 1.1標準曲線的繪制
[0030] 取6支試管，分別標號0、1、2、3、4、5按表1所不加入試劑，配制為lmg/ml的標準 牛血清蛋白溶液，立即搖勻后，在室溫下放置15min，以0號試管作為空白對照，于650nm處 測定各管吸光度值，并以標準蛋白液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標作圖，繪制牛血清蛋 白標準曲線。
[0031 ] 表1標準牛血清蛋白溶液的配制
[0033] 1. 2小球藻生物活性多肽提取率計算
[0034] 取4支試管，分別為實施例1、實施例2、實施例3，對比例，按表2加入試劑，配制為 lmg/ml多肽溶液，加入后立即搖勻后，在室溫下放置15min，于650nm處測定各管吸光度值， 照標準曲線即可求出提取液中多肽濃度并計算其提取率。
[0035] 表2小球藻生物活性多肽提取液的配制
[0037] 根據牛血清標準溶液，標準曲線的回歸方程為Y = I. 1850X+0. 0012R2= 1. 000
[0038] 根據標準方程可知本發明實施例1、2、3以及對比例采用的提取方法，小球藻小球 藻生物活性多肽提取率分別為16. 525 %、16. 425 %、16. 725 %、14. 113 %。
【主權項】
1. 一種利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，其特征在于：提取方法具體步驟如 下： 1) 破壁：配制濃度為10%的小球藻混懸液，經-20°c冷凍，后室溫下解凍。重復凍融過 程4次，每次冷凍12h ; 2) 小球藻蛋白提取：將步驟1中凍融完成小球藻混懸液置于磁力攪拌儀2. 5h、后低溫 (_2°C )離心10min,轉速控制2000_2500r/min，取上清液； 3) 生物多肽提取：將步驟2中含有小球藻蛋白上清液配制200ml濃度為2g/L溶液，調 節pH為8.5,置于泡沫分離器中，調節空氣流速為50ml/min、待泡沫產生開始計時20min，后 立即停止通氣，收集泡沫、冷凍（-KTC )真空干燥，即得多肽提取液。2. 根據權利要求1所述的一種利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，其特征在 于：步驟（3)為采用檸檬酸緩沖液調節pH為8. 5。
【專利摘要】本發明公開了一種利用小球藻蛋白提取生物活性多肽的方法，經過小球藻破壁、小球藻蛋白提取、以及最終獲得本發明的產品；具體過程采用了泡沫分離法與傳統酶法，與超臨界萃取技術相比，設備簡單，易操作，而且環保，提取得到的多肽液純度高，適用于工業化應用經本發明的方法小球藻蛋白生物活性多肽提取率范圍為16.525％±0.2％。
【IPC分類】C07K1/14
【公開號】CN105017380
【申請號】CN201510470960
【發明人】都寶君
【申請人】都寶君
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月5日