一種齊墩果酸內酯類衍生物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及齊墩果酸內酯類衍生物，具體屬于一種齊墩果酸內酯類衍生物及其制 備方法，以及其在制備減肥藥物和減肥保健品中的應用。
【背景技術】
[0002] 肥胖已成為全球最大慢性疾病[Haslam DW等，Lancet, 2005, 366:1197-1209]，可 引起II型糖尿病、心腦血管疾病、膽囊疾病、骨關節炎、阻塞性睡眠呼吸暫停、癌癥等，每年 至少 340 萬成人死于超重或肥胖[Baretic M 等，Digest Dis Sci.，2012, 30 (2) : 168-172 ; Derosa G 等，Expert Opin Drug Saf.，2012, 11(3)，459-471]。目前，奧利司他 (Orlistat)作為唯一一種長效減肥藥物，仍存在較大副作用，尤其會造成肝功能損 傷[Derosa G 等，Expert Opin Drug Saf. ,2012, 11(3)，459-471 ;Mary BC 等，Case Manager.，2004, 15 (6) :47-49]，而從天然植物中直接分離得到的化合物，減肥效果普遍較 低，所以有必要對其進行結構改造以提高它們的活性。
[0003] 齊墩果酸（Oleanolic acid)是自然界中含量最豐富的五環三萜類化合物，主要存 在于油橄欖、夏枯草、懷牛漆、連翹、青葉膽和女貞等植物中[Liu J等，J. Ethnopharmacol.， 1995, 49 (2) : 57-61 ;孟艷秋等，藥學學報，2015, 50 (4) : 469-474]，具有抑制胰脂肪酶 (Pancreatic lipase, PL)、降血糖、抗腫瘤、抗HIV、保肝、抗炎等多種藥理作用，且副作用小 [唐初等，有機化學，2013, 33:46-65 ;李文良等，中國藥物化學雜志，2014, 24:7-13 ;馬學惠 等，藥學學報，1982, 17:93-97]，是一理想的結構改造目標。
[0004] PL由胰腺分泌到十二指腸，可水解50 % -70 %的食物脂肪成甘油一酯和脂肪酸， 抑制PL活性可阻止脂肪分解，進而使其直接通過消化道排出體外，從而達到減肥目的。由 于該酶抑制劑直接在腸道內起作用，不需腸吸收，因而副作用較小，所以PL抑制類藥物研 發成為一種重要研究方向。
[0005] 本發明以PL作為藥物篩選靶標，以齊墩果酸為先導化合物，設計合成全新的齊墩 果酸內酯類衍生物，并就其減肥作用機理，即抑制胰脂肪酶作用及抑制類型進行了研究。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種齊墩果酸內酯類衍生物及其制備方法，以及齊墩果酸 內酯類衍生物在制備減肥藥物和減肥保健品中的應用。
[0007] 本發明提供的一種齊墩果酸內酯類衍生物，其結構式為：
[0008]
[0009] 其中：Rl代表氫、烷基、氨基、或酰胺基；R2代表烷基、含亞胺基團、或含硫基團。所 述的烷基為甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。所述的含亞胺基團為亞胺基、甲亞胺基、乙亞胺 基、丙亞胺基、丁亞胺基、或戊亞胺基。所述的含硫基團為甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基或 戊硫基。
[0010] 本發明齊墩果酸內酯類衍生物的制備路線：
[0012] 本發明提供的一種齊墩果酸內酯類衍生物的制備方法，包括如下步驟：
[0013] 1)先將齊墩果酸和碳酸氫鈉加入到DMSO中，然后滴加4_(溴甲基）氧雜環丁 烷-2-酮，室溫下攪拌，以TLC檢測反應終點；其中：齊墩果酸、碳酸氫鈉、4_(溴甲基）氧 雜環丁烷-2-酮的質量比為5:1-3:2-4 ;
[0014] 2)反應完畢后，加入齊墩果酸質量0. 1-1倍的蒸餾水，用乙酸乙酯萃取3次，合并 有機相，用無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮得到粗產品；
[0015] 3)粗產品經硅膠柱色譜純化，得白色粉末，純化條件：洗脫劑為體積比2-7:1的石 油醚和乙酸乙酯混合溶液。
[0016] 本發明的齊墩果酸內酯類衍生物可在制備減肥藥物和減肥保健品中的應用。
[0017] 本發明的齊墩果酸內酯類衍生物可作為原料藥與輔料組合制備成減肥藥物。
[0018] 與現有技術相比本發明的有益效果：
[0019] 本發明合成的齊墩果酸內酯類衍生物一一齊墩果烷-28-β -內酯，其結構經1H NMR、13C NMR及MS的確認。經體外實驗證明具有減肥作用，其作用機理是通過抑制胰脂 肪酶來達到減肥作用，其作用類型為競爭性抑制類型。齊墩果烷-28-β -內酯抑酶活性 (IC50:16. 4 μ mol · L 3 為齊墩果酸抑酶活性（IC50:87. 7 μ mol · L 3 的 5. 35 倍。
【附圖說明】
[0020] 圖1齊墩果烷-28- β -內酯氫譜
[0021] 圖2齊墩果烷-28- β -內酯碳譜
[0022] 圖3齊墩果烷-28-β -內酯質譜圖（Μ = 54L 32410)
[0023] 圖4齊墩果烷-28- β -內酯抑制胰脂肪酶活性
[0024] 圖5齊墩果烷-28- β -內酯可逆抑制與不可逆抑制判定
[0025] 圖6齊墩果烷-28- β -內酯抑制胰脂肪酶作用類型
【具體實施方式】
[0026] 實施例1齊墩果酸內酯類衍生物的合成和表征
[0027] 將300mg齊墩果酸和I IOmg碳酸氫鈉加入到4mL DMSO中，滴加163mg 4-( 溴甲基）氧雜環丁烷-2-酮，室溫下攪拌，以TLC檢測反應終點，24h反應完畢后， 加入5ml水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮得到粗產 品，經硅膠柱色譜純化，洗脫劑為石油醚-乙酸乙酯（5:1)，得白色粉末220. 56mg，產 率 62 %。4-匪1?(6001抱，〇)(：13)，5 0.71(8 0.71(8,3!1，〇13)，0.78(8,3!1，〇13)，0.89(8 ，3H，CH3)，0· 91 (s，3H，CH3)，0· 93 (s，3H，CH3) 0· 99 (s，3H，CH3)，1. 14 (s，3H，CH3)，1. 98 ~ 2. 03 (m，1H，H-12)，2. 81 ~2. 87 (m，1H，H-2)，3. 21 (dd，1H，J = 3. 6, 10. 8Hz，H-18)，3. 32 ~3· 58 (ddd，J = 4· 2, 16. 2, 98. 4Hz，2H，CH2O)，4. 11 ~4· 34 (ddd，J = 4· 2, 12. 6, 78. OHz ,2H, CH2), 4. 48 (m, 1H, CHO), 5. 31 (t, 1H, J = 3. 6Hz, H-12) ；13C NMR (150Hz, CDCl3) ,δ 17. 70, 17. 17, 18. 47, 23. 08, 23. 55, 23. 68, 26. 02, 27. 33, 27. 79, 28. 26, 30. 77, 32. 52, 32. 68, 32. 96, 33. 14, 33. 94, 34. 63, 37. 19, 38. 89, 39. 53, 40. 16, 41. 93, 45. 86, 46. 85, 47. 72, 55. 40, 63. 00, 67. 84, 69. 62, 73. 19, 79. 11, 123. 01, 143. 31, 177. 31 ；HRMS [M+H] calad 540. 3815, found 540. 3241.
[0028] 1H NMR、13C NMR及MS確認產物為齊墩果烷-28-β-內酯，見圖1、圖2、圖3所示。
[0029] 實施例2齊墩果烷-28- β -內酯抑制胰脂肪酶活性實驗
[0030] 采用對硝基苯酚法測定酶活。在反應體系中加入780 μ L Tris-HCl (pH = 8)，隨后 分別加入100 μ L的0. 5mg/mL的PL和20 μ L待測物質溶液，充分混勻，37°C下孵育15min 后，立即加入PNPB溶液（12. 5mmol/L)，混勻，將溶液點到96孔酶標板內，每個濃度設4個復 孔，檢測波長為400nm，在酶標儀上進行測定。每3min測定一個點，測定15min，記錄全部數 據。計算吸光度隨時間變化率K，根據如下公式計算抑制率：
[0031] PL的抑制率（％ ) = (1-K實驗/K空白）X 100
[0032] 試驗重復3次，結果取平均值。
[0033] 當抑制劑濃度為2ug/mL時，抑制率為15. 75%。
[0034] 當抑制劑濃度為8ug/mL時，抑制率為46. 70%。
[0035] 當抑制劑濃度為22ug/mL時，抑制率為76. 99%。
[0036] 齊墩果烷-28- β -內酯抑制胰脂肪酶活性IC50值如圖4所示。
[0037] 實施例3可逆抑制與不可逆抑制判定
[0038] 按照酶活性測試方法，在不同抑制劑濃度條件下，測定酶濃度不同（終濃度為 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5mg/mL)時殘余酶活，求出相應反應速度，以反應速度對加入酶量作 圖。結果如圖5所示。證明為可逆抑制。
[0039] 實施例4動力學抑制類型判定
[0040] 在給定抑制劑濃度、不同底物濃度（終濃度為2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、12. 5mmol/L)條 件下，按照酶活測試方法測定反應速度，按Lineweaver-Burk雙倒數作圖法作圖，根據對照 組和實驗組兩直線交點位置判斷抑制類型。
[0041] 齊墩果烷-28-β -內酯抑制胰脂肪酶作用類型如圖6所示。證明其為競爭性可逆 抑制類型。
【主權項】
1. 一種齊墩果酸內酯類衍生物，其特征在于，結構式為：其中：R1代表氫、烷基、氨基、或酰胺基；R2代表烷基、含亞胺基團、或含硫基團。2. 如權利要求1所述的一種齊墩果酸內酯類衍生物的制備方法，包括如下步驟： 1) 先將齊墩果酸和碳酸氫鈉加入到DMSO中，然后滴加4-(溴甲基）氧雜環丁烷-2-酮， 室溫下攪拌，以TLC檢測反應終點；其中：齊墩果酸、碳酸氫鈉、4-(溴甲基）氧雜環丁 烷-2-酮的質量比為5:1-3:2-4 ; 2) 反應完畢后，加入齊墩果酸質量0. 1-1倍的蒸餾水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機 相，用無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮得到粗產品； 3) 粗產品經硅膠柱色譜純化，得白色粉末，純化條件：洗脫劑為體積比2-7:1的石油醚 和乙酸乙酯混合溶液。3. 如權利要求1所述的一種齊墩果酸內酯類衍生物在制備減肥藥物中的應用。4. 如權利要求1所述的一種齊墩果酸內酯類衍生物在制備減肥保健品中的應用。5. -種減肥藥物，含有如權利要求1所述的齊墩果酸內酯類衍生物。
【專利摘要】本發明提供了一種齊墩果酸內酯類衍生物，如齊墩果烷-28-β-內酯，其制備步驟：先將齊墩果酸和碳酸氫鈉依次加入到DMSO中，然后滴加4-(溴甲基)氧雜環丁烷-2-酮，室溫下攪拌；反應完畢后，加入水，用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮得到粗產品，純化即可。體外實驗證明齊墩果酸內酯類衍生物具有減肥作用，其作用機理是通過抑制胰脂肪酶來達到減肥作用，其作用類型為競爭性抑制類型。齊墩果烷-28-β-內酯抑酶活性(IC50:16.4μmol·L-1)為齊墩果酸抑酶活性(IC50:87.7μmol·L-1)的5.35倍。該類衍生物可在制備新型胰脂肪酶抑制劑類減肥藥物和減肥保健品中應用。
【IPC分類】A61K31/585, C07J63/00, A23L1/30, A61P3/04
【公開號】CN105017374
【申請號】CN201510426498
【發明人】陳廷貴, 仝明明, 馬開慶, 張立偉, 席小莉
【申請人】山西大學
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月20日