一種檢測裂谷熱病毒的引物和探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸醫病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測裂谷熱病毒的引物 組和探針。即應用重組酶聚合酶等溫擴增技術（RecombinasePolymeraseAmplification， RPA)技術檢測裂谷熱病毒所用到的引物及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 裂谷熱（Riftvalleyfever，RVF)是由裂谷熱病毒（Riftvalleyfever virus，RVFV)引起反芻動物和人發病的人獸共患病。裂谷熱病毒可以通過蚊子或接觸血液、 體液、組織或患病動物而傳播。本病對綿羊、山羊、牛的影響較為嚴重，可引起懷孕動物的流 產和新生畜的死亡。大齡非懷孕動物也較易感，但臨床抗病性較強，動物的易感性與其本身 的遺傳差異有關，來自非洲以外及RVF非流行地區的動物對本病較易感。人對RVFV易感， 可通過接觸、處理感染性材料或通過蚊蟲媒介叮咬感染，人感染后通常無癥狀或者與主要 的自身限制性的發熱疾病相關。經過2 - 5天的潛伏期之后，病人可能經歷一個流感樣的 疾病，伴隨無顯著特點的疲勞，低燒，頭疼，畏光和關節疼痛。一些病人發展為昏倒。大量有 癥狀的病人將呈現肝炎。發熱通常持續一周，大部分自然康復，少于5%的病人將發展為綜 合征如腎炎、出血熱或者腦炎，死亡率高達10 - 12%。
[0003] 裂谷熱主要在西非和其他一些非洲國家呈地方性流行，在強降雨后牲畜和人群中 周期性流行。2000年病毒被傳播到阿拉伯半島，引起沙特和也門的疫情大暴發，這也是該病 第一次被傳播到在非洲大陸以外的地方，提示該病進一步擴散到其他地區的可能性進一步 增大。目前已經建立了幾種實時熒光RT-PCR方法來檢測該病，但這些方法普遍需要高昂的 儀器設備，并且無法滿足田間檢測的需要。為快速對裂谷熱做出診斷，急需建立一種使用易 讀取系統基礎之上的高靈敏性和特異性的實時檢測方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種應用RPA技術檢測裂谷熱病毒的引物及探針，從而彌補 現有技術的不足。
[0005] 本發明的引物及探針，其正向引物的序列為SEQIDNO:1，反向引物序列為SEQID NO: 2所示，探針序列為SEQIDNO: 3所示。
[0006] 其中探針RVFV-RPAp中的第27個堿基標記BHQl淬滅基團修飾，第28位堿基替換 為四氫咲喃（tetrahydrofuran)，第29位堿基標記FAM發光基團修飾，3'末端進行磷酸化 修飾。
[0007]本發明的引物及探針用于檢測裂谷熱病毒；
[0008] 本發明還提供了一種通過重組酶聚合酶等溫擴增技術檢測裂谷熱病毒的方法：提 取待檢樣品中的RNA作為模板，利用所述的引物和探針進行熒光快速檢測，如果有明顯的 熒光曲線擴增，則說明所檢測樣品中含有裂谷熱病毒核酸。
[0009] 本發明根據裂谷熱病毒基因組序列設計了大量RPA引物和探針，從中篩選出可快 速有效檢測裂谷熱病毒核酸的引物及探針組合。利用該套引物和探針進行快速檢測，以體 外轉錄的裂谷熱病毒核酸RNA作為陽性對照可以得到明顯的擴增曲線，其他病原核酸如口 蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體和藍舌病病毒為模板進行反應均沒有擴增曲線。
【附圖說明】
[0010] 圖1為裂谷熱病毒特異性檢測，其中1為裂谷熱病毒陽性對照，2-6分別為口蹄疫 病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體、藍舌病病毒和健康羊淋巴結。
[0011] 圖2為檢測靈敏度試驗圖，使用體外轉錄的RVFVRNA為模板，拷貝數從IO6到10° 低依次的檢測陽性率。
【具體實施方式】
[0012] 本發明通過對RVFV毒株進行序列比對后，獲得病毒保守性較高的區域，然后從該 區域設計引物及探針。所使用的引物和探針若檢測出特異性熒光曲線則為RVFV毒株。
[0013] 下面通過【具體實施方式】的詳細描述進一步闡明本發明。對于本發明具體實施例中 所采用的方法步驟，本領域的普通技術人員可以從現有技術中進行選擇替換，而并不僅限 于本發明的具體記載。
[0014] 實施例I :RPA檢測RVFV方法的建立
[0015] 根據GenBank中裂谷熱病毒基因組序列，設計引物和探針。引物長度約為 30-35nt，由于目前沒有針對RPA的引物設計軟件，本發明前期工作過程中設計合成了大量 引物，從中篩選出一對靈敏度高且特異性好的引物，引物和探針序列SEQIDNo. 1、SEQID No. 2、和SEQIDNo. 3(表 1)。
[0016] 表1:用于RPA檢測RVFV的引物和探針
[0017]
[0018]注：RVFV-RPAf中的K代表G或T，RVFV-RPAr中的Y代表T或C。RVFV-RPAp中的 第27個堿基標記BHQl淬滅基團修飾，第28位堿基替換為四氫呋喃（tetrahydrofuran)，第 29位堿基標記FAM發光基團修飾，3'末端進行磷酸化修飾。
[0019] 對于本發明設計的引物的靈敏度和特異性進行檢測，具體步驟及結果如下：
[0020] 1 ?材料與方法
[0021] (1)材料人工合成的裂谷熱病毒DNA、口蹄疫病毒、藍舌病病毒、羊支原體和羊傳 染性膿皰病毒，以及健康羊淋巴結樣品。引物和探針由上海生工生物技術有限公司合成，其 他試劑均為進口分裝或國產分析純。
[0022] (2)病原核酸提取取200y1病原培養物或經2000g離心后的組織勻漿液，使用 Roche公司的HighPurePCRTemplatePreparationkit按照產品說明書提取各種材料中 的總核酸。
[0023] (4)體外轉錄制備裂谷熱病毒模板將人工合成的裂谷熱病毒Sudan30_2010株 (JQ820481)擴增目標基因連接到pGEM-T載體上，單酶切成線性質粒，然后按照Riboprobe InvitroTranscriptionsystems的說明書進行體外轉錄，產物經DNaseI消化、3M的醋 酸鈉乙醇沉淀后，溶解于無RNase的水中，測定濃度后計算出對應拷貝數，依次從IO6拷貝/ y1以10倍倍比稀釋至10°個拷貝/y1。-70°C保存。
[0024] (3)RPA擴增使用TwistAmpexo(TwistDx，Cambridge，UK)試劑盒在 50y1 反應體 系進行RPA試驗，首先在I. 5ml離心管中加入再水化緩沖液29. 5y1，Transcriptor反轉錄 酶（Roche)O. 5y1，10yM的引物各 2.Iy1，10yM的TwistAmpexo探針 0? 6y1，模板RNA 和dH20 12. 7y1，渦旋混勻短暫離心后，將前述混合液加入到RPA凍干酶球的反應管中，加 入280mM的醋酸鎂溶液2. 5y1，混勻，將反應管置于RPA擴增檢測儀（Twista)或熒光定量 PCR儀中，37°C反應15分鐘。以不同種類的病原核酸和健康羊總核酸為模板進行特異性檢 測，以不同稀釋度的RNA標準為模板進行反應的靈敏性檢測。
[0025] 2?結果
[0026] 2. 1特異性結果
[0027]用本發明所設計的引物和探針進行快速檢測，以裂谷熱病毒核酸RNA為模板均可 以得到明顯的擴增曲線，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體、藍 舌病病毒和健康羊淋巴結總核酸為模板進行RPA反應均沒有擴增曲線（圖1)。
[0028] 2. 2靈敏性結果
[0029] 將病毒核酸10倍稀釋至多個梯度，每個梯度重復10次檢測，使用統計軟件計算出 在模板低至約1〇〇個拷貝時有95%的檢出率，具有高靈敏度（圖2)。
[0030] 實施例2RPA檢測技術在臨床樣品中的檢測應用
[0031] 使用實施例1中建立的方法，在2014年7月至9月期間對國內云南、廣西和廣東 等三省送檢的30份羊口鼻拭子和組織病料臨床樣品進行抽樣檢測。使用商品化試劑盒 (Roche公司的HighPurePCRTemplatePreparationkit)提取樣品中的總核酸模板，用 建立的RPA方法檢測這些樣品中是否含有RVFV;同時參照世界動物衛生組織（OIE)推薦的 Real-timeRT-PCR方法進行檢測。結果兩種檢測方法的檢測結果一致，只陽性對照有陽性 擴增曲線，而在臨床樣品中均沒有檢測出陽性樣品。
【主權項】
1. 引物及探針，其特征在于，所述的引物中的正向引物的序列為SEQ ID NO :1，反向引 物序列為SEQ ID NO :2,探針序列為SEQ ID NO :3。2. 如權利要求1所述的引物及探針，其特征在于，所述的探針的第27個堿基被標記 BHQl淬滅基團修飾。3. 如權利要求2所述的引物及探針，其特征在于，所述的探針的第28位堿基替換為四 氫呋喃。4. 如權利要求3所述的引物及探針，其特征在于，所述的探針的第29位堿基標記FAM 發光基團修飾。5. 如權利要求4所述的引物及探針，其特征在于，所述的探針的3'末端進行磷酸化修 飾。6. 權利要求1所述的引物及探針用于檢測裂谷熱病毒。7. -種用于檢測檢測裂谷熱病毒的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含有權利要 求1所述的引物及探針。8. -種通過重組酶聚合酶等溫擴增技術檢測裂谷熱病毒的方法，其特征在于，所述的 方法的步驟如下： 提取待檢樣品中的RNA作為模板，利用權利要求1所述的引物及探針進行熒光快速檢 測，如果有明顯的熒光曲線擴增，則說明所檢測樣品中含有裂谷熱病毒核酸。
【專利摘要】本發明的目的是提供一種應用RPA技術檢測裂谷熱病毒的引物及探針，其正向引物的序列為SEQ？ID？NO：1，反向引物序列為SEQ？ID？NO：2所示，探針序列為SEQ？ID？NO：3所示。本發明根據裂谷熱病毒基因組序列設計了大量RPA引物和探針，從中篩選出可快速有效檢測裂谷熱病毒核酸的引物及探針組合。利用該套引物和探針進行快速檢測，以體外轉錄的裂谷熱病毒核酸RNA作為陽性對照可以得到明顯的擴增曲線，其他病原核酸如口蹄疫病毒、羊傳染性膿皰病毒、山羊支原體和藍舌病病毒為模板進行反應均沒有擴增曲線。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70, C12R1/93
【公開號】CN105002302
【申請號】CN201510468141
【發明人】李林, 吳曉東, 劉春菊, 鄒艷麗, 王 華, 王清華, 王志亮
【申請人】中國動物衛生與流行病學中心
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月31日