一種克隆豬lyrm1基因cds區序列的方法
【技術領域】
[000。 本發明設及分子遺傳學領域，尤其是設及豬的LYRM1基因CDS區序列克隆技術。
【背景技術】
[0002] LYRM1 (LYR motif containing 1)是應用抑制性消減雜交技術篩選肥胖者與健 康人群腹膜脂肪組織的差異表達基因時所篩選出的一條新基因，該基因定位于人染色體 16pll.2,有4個外顯子和3個內含子，mRNA全長1589 bp，開放閱讀框302-670 bp，編碼122 個氨基酸。前期研究發現該基因高表達于肥胖者脂肪組織，可促進前體脂肪細胞的增殖、抑 制前體脂肪細胞的調亡，過表達LYRM1基因可引起成熟脂肪細胞線粒體形態結構損傷和功 能障礙，同時導致成熟脂肪細胞膜島素刺激下葡萄糖攝取率的降低。朱冠忠等研究表明， LYRM1基因沉默能夠引起成熟脂肪細胞M化2 mRNA表達水平升高，說明LYRM1基因沉默可 部分影響成熟脂肪細胞線粒體形態相關基因。陳福坤等還發現LYRM1基因具有抑制P19細 胞調亡的作用，同時在人的屯、臟組織中高表達。邱潔等通過構建LYRM1綠色巧光蛋白融合 載體，將LYRM1編碼蛋白在細胞中定位于胞核中，構建了 LYRM1原核表達載體及真核表達載 體，并獲取LYRM1重組蛋白，建立穩定過表達人LYRM1基因的3T3-L1前體脂肪細胞系。采 用人工合成多膚作為半抗原成功制備了人類肥胖相關新基因LYRM1的多克隆抗體。吳丹等 對北京油雞不同日齡階段體質量進行GWAS研究發現，在9個SNPs位點達5%全基因組顯著 水平位點基因包含LYRM1。梁慎等亦發現在西瓜枯萎病菌中LYRM1基因對調控生長發育及 其致病性相關。
[0003] 上述研究結果提示，豬LYRM1基因可能與其生產水平、肉質性狀等有關聯。國內未 見關于豬LYRM1基因的相關研究報道，NCBI數據庫中關于豬LYRM1基因的序列亦為預測序 列，尚無準確的序列上傳記錄及相關的文獻報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是：提供一種克隆豬LYRM1基因CDS區序列的方法，它準確性高，為 構建豬LYRM1基因的原核、真核表達載體及相關動物模型等研究提供基礎材料。
[0005] 本發明是運樣實現的：克隆豬LYRM1基因CDS區序列的方法，對豬的組織提取總 RNA，逆轉錄總RNA為cDNA后，設計特異性引物，上游引物：TGACATTCCTGAGACCAGAGT，下游引 物：GGCCTACTTGACTCATCATTCT，擴增豬的LYRM1基因，擴增產物連接于PMD19-T Vector后， 構建PMD19-T-LYRM1-CDS重組質粒，對重組質粒進行測序，克隆豬LYRM1基因為524bp，其中 包含完整CDS區序列384bp，其余部分為UTR區序列。
[0006] 本發明通過對豬的組織提取總RNA，逆轉錄為cDNA后，設計特異性引物擴增豬的 LYRM1基因，PCR擴增的目的片段包含豬的LYRM1基因的完整CDS區序列及部分UTR區，最 終構建PMD19-T-LYRM1-CDS重組質粒，并對其進行測序，測序結果與NCBI數據庫中預測的 LYRM1基因CDS區序列進行比對驗證，為構建豬的LYRM1基因的原核、真核表達載體及相關 動物模型等研究提供基礎材料。
【附圖說明】
[0007]圖1為豬cDNA LYRM1基因CDS區PCR產物電泳圖； 圖2為PMD19-T-LYRM1-CDS重組質粒PCR產物電泳圖； 圖3為PMD19-T-LYRM1-CDS重組質粒測序圖譜。
【具體實施方式】
[000引本發明的實施例：一種克隆豬LYRM1基因CDS區序列的方法， 1、豬總RNA的提取及cDNA合成 取白洗豬背最長肌組織進行總RNA提取，提取方法參照Invitrogen公司TRIZ化 積Reagent試劑盒說明書進行，所得總RNA逆轉錄合成為cDNA，逆轉錄方法參照北京康為世 紀生物科技有限公司化FiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行。
[0009] 2、豬LYRM1基因CDS區序列引物設計 參照NCBI數據庫預測的豬LYRM1基因四個剪輯變異體序列（GenBank登陸號為： XM_005662093. 1、XM_005662094. 1、XM_005662095. 1、XM_005662096. 1)對豬 LYRM1 基因 CDS 區進行預測，針對預測序列進行引物設計，設計的引物序列如下： 上游引物序列：TGACATTCCTGAGACCAGAGT 下游引物序列：GGCCTACTTGACTCATCATTCT 預擴增片段長度為524bp，其中包含完整CDS區及部分UTR區。
[0010] 3、豬LYRM1基因CDS區序列的PCR擴增 PCR擴增條件為95°C預變性5min ;94°C變性30s，62. 5°C退火35s，72°C延伸35s，X35 個循環；72°C終延伸5min，4°C保存。PCR擴增標準體系見表1。 東1澤LYKM1基因CDS區巧巧JPCR巧應標準巧系
[0011] 4、重組質粒的構建及測序 豬LYRM1基因CDS區PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后（圖1)，用上海生工生物工程技 術服務有限公司SanPr巧柱式DNA膠回收試劑盒進行回收純化，純化產物按照TaKaRa公司 PMD19-T Vector試劑盒說明書進行操作，采用藍白斑法篩選克隆產物，最終提取重組質粒 DNA (圖2)后送生物公司測序。
[0012] 5、測序結果比對及驗證 重組質粒測序如圖3所示，序列結果參見序列表1，說明本發明的準確性很好。
[0013] 擴增目的片段長度為524bp，其中包含完整CDS區序列384bp及部分UTR區序列， 其中灰色標注部分為豬LYRM1基因完整CDS區序列，所構建的重組質粒序列與NCBI數據庫 剪輯變異體序列比對相符，說明豬的LYRM1基因CDS區序列克隆成功。
【主權項】
1. 一種克隆豬LYRMl基因⑶S區序列的方法，其特征在于：對豬的組織提取總RNA， 逆轉錄總RNA為cDNA后，設計特異性引物，上游引物：TGACATTCCTGAGACCAGAGT，下游引物： GGCCTACTTGACTCATCAITCT，擴增豬的LYRMl基因，擴增產物連接于pMD19-T Vector后，構建 PMD19-T-LYRM1-CDS重組質粒，對重組質粒進行測序，克隆豬LYRMl基因為524bp，其中包含 完整⑶S區序列384bp，其余部分為UTR區序列。
【專利摘要】本發明公開了一種克隆豬LYRM1基因CDS區序列的方法，所述方法通過對豬的組織提取總RNA，逆轉錄為cDNA后，設計特異性引物擴增豬的LYRM1基因，PCR擴增目的片段包含豬的LYRM1基因的完整CDS區序列及部分UTR區，擴增產物連接于pMD19-T？Vector后，構建pMD19-T-LYRM1-CDS重組質粒，并對其進行測序，測序結果與NCBI數據庫中預測的LYRM1基因CDS區序列進行比對驗證，為構建豬的LYRM1基因的原核、真核表達載體及相關動物模型等研究提供基礎材料。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105002164
【申請號】CN201510499172
【發明人】陳祥, 馮文武, 孫振梅, 李鵬程, 許厚強, 丁玫, 陳偉
【申請人】貴州大學
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月14日