中成藥或含中藥材保健品的dna的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物檢測技術領域，更具體地，本發明設及一種優化的中成藥或含中 藥材保健品的DNA的提取方法。
【背景技術】
[0002] CTAB (hexade巧Itrimeth^ammonium bromide,十六烷基S甲基漠化錠）是一種陽 離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶 液中（〉0. 7mol/L化C1)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有 機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酪類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。
[0003] 在傳統CTAB法提取中成藥或含中藥材保健品中的DNA的過程中，異丙醇沉淀DNA 時出現分層現象，造成DNA提取量極低；申請人發現運是由于輔料添加淀粉或者藥源性淀 粉對傳統CTAB法提取DNA造成了不利影響。如果不對傳統CTAB法進行改進，分子鑒定技 術難W成為中成藥或含中藥材保健品的常規檢測技術。
【發明內容】
[0004] 基于此，本發明的目的在于提供一種改良的提取中成藥或含中藥材保健品的DNA 的方法，旨在解決由于輔料添加淀粉或者藥源性淀粉對傳統CTAB法提取DNA造成的不利影 響，從而提局DNA的提取效率和質量。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明采取了 W下技術方案：
[0006] 一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，在傳統CTAB法過程中增加了甲 醇沉淀DNA的步驟。
[0007] 在其中一些實施例中，所述甲醇沉淀DNA的步驟發生在異丙醇沉淀之前，或者發 生在異丙醇沉淀之后。優選在異丙醇沉淀之前。
[0008] 在其中一些實施例中，所述甲醇的工作濃度為60~90%。
[0009] 在其中一些實施例中，所述甲醇的工作濃度為70%。
[0010] 本發明通過系統篩查中成藥或含中藥材保健品中存在的各種成分及其性質，分析 傳統CTAB法提取過程中影響DNA產量和質量的原因，首次發現中成藥或含中藥材的保健品 中的淀粉類成分會與CTAB形成高極性的復合物，從而大大影響了 DNA的沉淀分離效果，導 致沉淀效果低，也影響了 DNA的質量。與現有技術相比，本發明具有W下有益效果： 1] 1、本發明的DNA提取方法發現在CTAB法過程的任何步驟中增加甲醇沉淀DNA的 步驟，都可W顯著提高DNA的產量和質量，并能成功進行DNA分子鑒定。由于甲醇與乙醇、 異丙醇性質相似，傳統CTAB方法已經使用了乙醇或異丙醇進行處理，故當傳統方法提取的 DNA達不到分子鑒定的要求時，本領域技術人員一般不會考慮使用甲醇解決此問題，本發明 創造性地在傳統CTAB方法中增加一個關鍵的甲醇沉淀步驟，解決了此問題，具有顯著的新 穎性和獨創性；
[0012] 2、本發明W人參類成藥制劑為例，考察了甲醇和乙醇用于沉淀、分離中成藥或含 中藥材保健品的DM的效果比較試驗，比較試驗的設計分別觀察了 DM提取率和上清殘留 兩個指標，DNA提取率、上清液DNA巧光分析兩種方法互補優勢，從而得出更為客觀的結果 和分析；W人參類成藥制劑為例闡述成藥制劑DNA提取技術，有效避免了因為DNA量低質差 而無法跑出理想DNA電泳條帶的缺陷，通過分子鑒定結果評估優化了的DNA提取技術顯得 更有說服力。
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明實施例1中的11種含人參中成藥或保健品的分子鑒定圖譜；
[0014] 圖2為本發明試驗例1中采用甲醇和乙醇沉淀DNA的提取率比較圖；
[0015] 圖3為本發明試驗例1中采用甲醇和乙醇沉淀DNA時的相對巧光強度比較圖。
【具體實施方式】
[0016]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，W下結合實施例，對本發明 進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發明，并不用于限定 本發明。
[0017] 下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理做進一步描述。
[0018] W下實施例中，所用試劑均為分析純，除了特殊說明外，所有試劑均來源于市售。
[0019] 實施例1
[0020] 本實施例的一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，包括W下步驟： 陽02U (1)、分別將表1所示的樣品細粉約2g置于10ml離屯、管中，加65°C預熱的2XCTAB 提取緩沖液2. 5ml及琉基乙醇100 y L于65°C水浴裂解化，8 000巧m離屯、5min，期間常顛 倒混勻；
[0022] 表1試驗用人參類成藥制劑情況
[0023]
陽0巧](2)、取上清液加甲醇5ml，-20°C沉淀比，8 000巧m離屯、5min ; 陽0%] (3)、取沉淀轉移到2ml EP管中，加入65°C預熱的2XCTAB提取緩沖液600 y L及 琉基乙醇16 置于65°C裂解20min，期間常震蕩；
[0027] (4)、加等體積氯仿：異戊醇（24:1)顛倒混勻5min，12 00化pm離屯、15min ;取上清 液加等體積-20°C預冷的異丙醇，-20°C沉淀化，12 00化pm離屯、15min ;
[0028] 巧）、取沉淀用無菌水600 yL溶解，隨后加入乙醇1 200 yL及3M醋酸鋼溶液 60 y L，混勻，置-20°C沉淀比，12 00化pm離屯、15min，根據DNA的質量重復本操作2~3次；
[0029] 化）、取沉淀置于37°C烘箱溫育比，直至乙醇揮干，隨后加約200iiL無菌水溶 解，-20°C冷凍備用，即得DNA模板。
[0030] 使用化ngtaoWang等的方法對采用該實施例提取的DNA進行分子鑒定。
[0031] 基于SNP方法針對人參ETS基因設計特征性引物ETSR燈TTGCAAGTCGTGTGAGTTG); A評(GTGTTGGCATAGTGTACGTTA) ;P評(AGAGCAGTAAGCCTTGGAAAAT)。
[0032]使用 50 y L 體系：DNA 模板 lOng、引物各 0. 5 化，W 及 10 y L2XPremixDNA polymerase,補水至 50yL ;
[0033] PCR反應程序為：94°C變性4min，然后94°C解鏈30s、63°C退火30s、72°C延伸30s 進行35次循環，72°C延伸5min，4°C保存。
[0034]通過10 %瓊脂糖矣別父檢測，結果如圖1所不。11種商品中,序號為1、2、3、4、6、7、 8、10的樣品與商品描述相符合，序號為11的樣品有滲偽情況，序號為5、9的樣品與商品描 述不相符。 陽0對實施例2
[0036] 本實施例的一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，包括W下步驟：
[0037](1)、分別取表1所列的樣品細粉若干，置于2ml的EP管中，加65°C預熱的2 X CTAB 提取緩沖液600 y 1及琉基乙醇16 y 1，于65°C裂解化，期間常顛倒混勻；
[0038] (2)、加等體積氯仿-異戊醇（24:1)顛倒混勻5min，12 000巧m離屯、15min ;取上 清液加等體積-20°C預冷的異丙醇，-20°C沉淀化，12 00化pm離屯、15min ;
[0039](3)、取下層溶液補無菌水至600 y 1，加甲醇1200 y 1及3M醋酸鋼溶液60 y 1，混 勻，置-20°C沉淀比，12 000巧m離屯、15min ; W40] (4)、取沉淀，用無菌水600iiL溶解，隨后加入乙醇1 200iiL及的3M醋酸鋼溶液 60yL，混勻，置-20°C沉淀比，12 00化pm離屯、15min，根據DNA的質量重復本操作2~3次；
[0041] 巧）、取沉淀，置于37°C烘箱溫育比，直至乙醇揮干，隨后加無菌水100~200iiL 溶解，-20°C冷凍備用，即得DM模板。
[0042] 對采用該實施例提取的DNA采用實施例1下的相同方法進行分子鑒定，通過10% 瓊脂糖凝膠檢測，結果與實施例1的相同。 陽0創試驗例1甲醇和乙醇沉淀對DNA提取效率的影響
[0044] 本試驗例W人參類成藥制劑為例，考察了甲醇和乙醇用于沉淀、分離中成藥或含 中藥材保健品的DNAW及來自于人參葉的標準DNA的效果比較試驗，結果分別如表2、圖2 和圖3所示。
[0045] 表2不同DNA提取試驗微量分光亮度計檢測值（N= 3)
[0046]
[0047] ***T-Tes巧<0. 01，與傳統方法比較。
[0048] 從表2結果可知，在異丙醇沉淀之前增加一步甲醇沉淀DNA步驟，可W顯著提高 DM的產量和質量，并能成功進行DNA分子鑒定。從圖2和圖3結果可知，與乙醇相比，使用 甲醇進行沉淀標準DNA，具有更高的提取率，且甲醇的工作濃度為60-90%，最佳工作濃度 為 70%。 W例 CTAB法提取中成藥或含中藥材保健品的DNA過程中遇到困難，是一個實驗人員已 經關注到便沒有被解決的問題。本發明的發明人在使用傳統CTAB法提取人參類成藥制劑， 并對其進行分子鑒定時，因為DNA提取困難，無檢測結果，其劑型主要為顆粒劑、粉劑。經過 分析，發現其原因在于中成藥中所含的淀粉與CTAB在加熱條件下反應生成高極性富正電 荷的復合物，并影響了的DNA沉淀效果，進一步發現采用甲醇處理可W有效去除運種復合 物的影響，W人參類成藥制劑為例闡述成藥制劑DNA提取技術優化過程，最終建立的優化 方法有效避免了傳統CTAB法用于中成藥時因為提取得到的DNA量少質差而無法跑出理想 DNA電泳條帶的缺陷，采用該優化方法提取得到的DNA可成功用于含人參中成藥的人參藥 材分子鑒定，使得該DNA提取技術更有說服力。
[0050] W上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用W限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內， 如：在整個CTAB法提取中成藥或保健品DNA過程中任何步驟使用甲醇沉淀、純化DNA也在 本發明之內。
[0051] W上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干變形和改進，運些都屬于本發明的保護 范圍。因此，本發明專利的保護范圍應W所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在于，在傳統CTAB法過程 中增加了甲醇沉淀DNA的步驟。2. 根據權利要求1所述的中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在于，所 述甲醇沉淀DNA的步驟發生在異丙醇沉淀之前，或者發生在異丙醇沉淀之后。3. 根據權利要求1或2所述的中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在 于，所述甲醇的工作濃度為60~90 %。4. 根據權利要求3所述的中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其特征在于，所 述甲醇的工作濃度為70%。
【專利摘要】本發明公開了一種中成藥或含中藥材保健品的DNA的提取方法，其是在傳統CTAB法過程中增加了甲醇沉淀DNA的步驟。本發明通過系統篩查CTAB法提取過程中影響DNA產量和質量的原因，首次發現中成藥及含中藥材的保健品中的淀粉類成分會與CTAB形成高極性的復合物，從而影響后續異丙醇沉淀DNA的效果，本發明發現在CTAB法過程中的任何步驟增加甲醇沉淀DNA的步驟，則可以顯著提高DNA的產量和質量，并能成功進行DNA分子鑒定。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105002160
【申請號】CN201510415609
【發明人】周華, 程春松, 劉良
【申請人】澳門科技大學
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月15日