一種郁金香碎色病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及微生物檢測領域，具體地說，本發明設及一種郁金香碎色病毒RT-LAMP 檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 郁金香是國際名花之一，W高貴、典雅為世界人民所寵愛，是歐亞等地區近20個 國家的國花。近年來，我國各地相繼舉辦了郁金香花展，獲得了較好的效益。雖然郁金香在 我國很早就有少量栽培，但大部分仍從荷蘭等國家進口。20世紀80年代中后期W來，我國 從國外引進郁金香商品種球數量逐年成倍增長，其攜帶的一些有害生物也隨之傳入，包括 真菌、細菌、線蟲和病毒等，潛在危害性很大。郁金香碎色病是種球常見感染之一，其造成種 球退化，嚴重影響了郁金香的生產。
[0003]引起郁金香碎色病的病原體是郁金香碎色病毒（Tulipabreakingvirus,TuBV)， 病毒粒子大小為7〇〇nmX(12-13)nm。感染化BV的主要癥狀是葉片出現淺綠色或灰白色 條斑，有時形成花葉，在紅花和紫花品種上產生碎色花，花瓣上形成大小不等淺色斑點或條 斑，嚴重時植株生長不良，還可危害百合類花弁。
[0004] 目前檢測郁金香病毒多使用抗血清的化ISA法或RT-PCR法，然而該兩種方法均存 在不足；ELISA法須制作抗血清，非特異反應多，易產生假陽性或假陰性結果，而RT-PCR靈 敏度和特異性不高。因此，有必要開發一種快速、準確的化BV檢測方法，W滿足產業需求。
[0005] 環介導恒溫核酸擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP) 是近些年發展起來的一種新型的核酸擴增方法（見文獻NotomiT,化ayamaH,Masubuchi H,YonekawaT,WatanabeK,AminoN,HaseT.Loop-mediatedisothermalamplification ofDM.NucleicAcidsRes. 2000化n15 ;28 (12):E63)。與常規PCR相比，LAMP無需模板 的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程，短時間內即可實現大量拷貝數的核酸擴增， 且無需高端的儀器設備，具有特異性強、靈敏度高、易于判讀、可定性定量等優勢。
[0006] 逆轉錄環介導等溫擴增技術（RT-LAM巧是基于LAMP建立的RNA檢測技術，其靈敏 度是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP擴增原理與LAMP相同，但在反應體系中增加了逆轉錄 酶，使RNA的逆轉錄和cDNA的LAMP擴增在同一試管中一步完成。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種郁金香碎色病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法。
[0008] 為了實現本發明的目的，在一個方面中，本發明提供一種郁金香碎色病毒RT-LAMP 檢測試劑盒，其包括引物、反應緩沖液、AMV逆轉錄酶、BstDM聚合酶和核酸染料，其中所述 引物的核巧酸序列如下所示：
[0009] 外引物F3 ;TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDN0:1)
[0010] 外引物B3 ;CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDN0:2)
[0011] 內引物FIP;CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
[0012] GTTAAATCTGGAGTGT(沈QIDN0:3)
[0013]內引物BIP;ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC
[0014]AACTGCTCG(SEQIDN0:4)〇
[0015] 優選地，所述外引物F3和所述外引物B3的濃度均為5pmol/y1，所述內引物FIP 和所述內引物BIP的濃度均為40pmol/y1。
[0016] 優選地，所述反應緩沖液由lOmMdNTP、10X化ermoPol反應緩沖液、5mM甜菜堿和 50mMM拆〇4組成。
[0017] 優選地，所述BstDNA聚合酶的濃度為8U/y1。
[0018] 優選地，所述核酸染料為SYBRGreenI。
[0019] 優選地，本發明的試劑盒進一步包括RNA提取試劑W及陽性對照和陰性對照。
[0020] 在另一個方面中，本發明還提供一種郁金香碎色病毒RT-LAMP檢測方法，其包括 W下步驟：
[0021] (1)利用TIANamp病毒RNA提取試劑盒提取待測樣品RNA;
[002引 （2)設計并合成引物，其中所述引物的核巧酸序列如下所示：
[0023]外引物F3 ;TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQIDN0:1)
[0024]外引物B3 ;CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQIDN0:2)
[00巧] 內引物FIP;CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
[0026]GTTAAATCTGGAGTGT(沈QIDNO:3)
[0027] 內引物BIP;ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC
[0028]AACTGCTCG(SEQIDNO:4)；
[002引 做在PCR管中制備25yl的RT-LAMP反應體系，其包括5pmol/yl的外引物 F31yl、5pmol/yl的外引物B31yl、40pmol/yl的內引物FIPlyl、40pmol/yl的內弓| 物BIPlyl、反應緩沖液2. 5yl、2UAMV逆轉錄酶lyl、8UBstDNA聚合酶lyl、模板 DM2yl，加水補充至25yl，并W郁金香碎色病毒基因組DM作為陽性對照，WlOOmM Tris-肥1P服.0和50mM邸TA作為陰性對照；
[0030] (4)LAMP反應；將步驟（3)中PCR管于63°C恒溫反應60min;
[003。妨分析判斷反應產物結果；在（4)中所得反應產物中加入1y1核酸染料，如反 應液顏色為澄色，表示結果為陰性，如反應液顏色為綠色，表示結果為陽性。
[003引優選地，所述反應緩沖液由lOmMdNTP、10XThermo化1反應緩沖液、5mM甜菜堿和 50mMM拆04組成。
[0033] 優選地，所述核酸染料為SYBRGreenI。
[0034] 本發明的郁金香碎色病毒RT-LAMP檢測試劑盒和檢測方法針對病毒保守區域設 計特異性和靈敏度高的四條引物，且一步完成逆轉靈和擴增步驟，假陽性率低、快速、高效， 且通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，無需電泳和紫外觀察等步驟，鑒定簡便，較傳統的 檢測方法優勢顯著。
【具體實施方式】
[0035]W下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0036] 實施例1本發明的郁金香碎色病毒RT-LAMP檢測試劑盒的制備
[0037] 1. 1試劑
[00測引物由天根生化科技（北京）有限公司合成；BstDM聚合酶和10X化ermoPol反 應緩沖液購自肥B;AMV逆轉錄酶購自Promega公司；SYBRGreenI購自Invitrogen;其余 PCR試劑和配制CTAB抽提緩沖液所需的試劑購自Sigma。