一種檢測xrcc1基因多態性的引物與方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，尤其設及一種檢測XRCC1基因多態性的引物與方 法。
【背景技術】
[0002] 銷類抗癌藥物，包括順銷、卡銷和奧沙利銷等，是目前臨床應用中對多種癌癥具有 較高活性的抗癌藥物，主要通過引起細胞內DNA損傷來清除癌細胞。
[0003] X線修復交叉互補基團1aRCCl)，位于人類染色體19ql3. 2-13. 3,大小為33化， XRCC1是第一個分離到的影響細胞對電離福射敏感性的哺乳動物基因，廣泛參與DNA損傷 的修復。
[0004] 現有研究數據顯示，XRCC1_R399QR/R，R/Q和Q/Q基因型頻率分別約為55%，37〇/〇， 8%。因此，通過XRCC1基因多態性的檢測，有助于預測銷類藥物化療的預后，在幫助指導用 藥和個性化治療方面具有重要意義。現有技術缺少一種特異性好、靈敏度高、可實現XRCC1 基因多態性檢測的引物及其方法。
【發明內容】
[0005] 為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種檢測XRCC1基因多態性的引物與 方法，具有特異性好、靈敏度高、準確性好等優點。本發明檢測的位點包括XRCC1_R399Q; C.1196A>G(p.Gln399Arg)(SNP；rs25487) 〇
[000引本發明提供一種檢測XRCCl基因多態性的引物，包括PCR擴增引物 和SNaPshotPCR引物；所述PCR擴增引物包括：針對XRCC1_R399Q的上游引物 5，-TCTGACTCCCCTCCAGATT-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物5'-GCCCCTCAGATCACACCTA-3'（SEQ IDNO. 2);所述SNaPshotPCR引物包括；針對XRCC1_R399Q的SNaPshotPCR引物 5，-CGTCGGCGGCTGCCCTCCC-3'（SEQIDNO. 3)。
[0007] 采用上述技術方案，本發明提供的檢測XRCCl基因多態性的引物，可w實現XRCCl 基因多態性的特異性檢測，準確性好。
[000引相應地，本發明還提供一種檢測XRCC1基因多態性的方法，包括如下步驟；A)提取DNA樣品；B)采用權利要求1中所述的PCR擴增引物進行PCR擴增，對擴增產物進行純化； C)采用權利要求1中所述的SNaPshotPCR引物進行SNaPshotPCR擴增，對擴增產物進行 純化；D)毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0009] 優選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
[0010] 優選地，所述步驟B)中的PCR擴增反應條件包括；階段1 ;98°C3min;階段2 : 981：1〇3;階段3;581：3〇3;階段4;721：1111111;階段5;返回到階段2,29個循環；階段6; 72°C5min;階段 7;25°C保溫。即，St巧 1 ;98。Cfor3minutes;Step2 ;98。Cfor10 seconds；Step3 ；58°Cfor30seconds；Step4 ；72°Cfor1minute；Step5；Goto step2, 29times；Step6 ；72°Cfor5minutes；Step7 ；25°Cforever。
[0011] 所述步驟c)中的SNaPshot PCR擴增反應條件包括；階段1;96它10s;階段2: 55它5s;階段3;6(TC 30s;階段4;返回到階段1，25個循環；階段5:4它保溫。即，St邱 1；96° C forlOseconds ;Step 2；55° C for 5 seconds ;Step 3；60° C for SOseconds ; Step 4 ；Go to step 1，25 times ;Step 5；4° C forever。
[0012] 優選地，所述步驟D)中，采用GE肥MAP陽RIDV4. 1軟件對檢測結果進行分析。
[0013] 此外，本發明還提供檢測XRCC1基因多態性的引物在制備檢測XRCC1基因多態性 試劑中的用途。
[0014] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明提供了一種檢測XRCC1基因多態 性的引物，引物的特異性好，準確性好，實現了XRCC1基因多態性的檢測，提高了檢測效率。 此外，本發明還提供了一種檢測XRCC1基因多態性的SNaPshot法，通過使用特異性的PCR 擴增引物和SNaPshotPCR引物，具有特異性好、靈敏度高、準確性好等優點，可W為銷類藥 物的臨床用藥提供指導。
【附圖說明】
[0015] 圖1本發明提供的XRCC1基因引物的擴增片段。
[0016] 圖2XRCC1基因引物擴增產物的部分測序圖。
[0017] 圖3樣品的XRCC1基因多態性檢測結果圖。
【具體實施方式】
[001引下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。
[001引實施例一引物 發明人針對XRCC1的基因多態性位點，設計了大量引物，通過引物反應條件的優化和 比較，篩選出了特異性好的引物。本發明提供的引物包括PCR擴增引物和SNaPshotPCR引 物，PCR擴增引物和SNaPshotPCR引物是相對應的。本發明提供的所有引物序列均通過 UCSC數據庫比對，無已知SNP位點。
[0020] 實施例二引物的特異性 將本發明提供的引物于UCSC中進行Blasting,XRCC1_R399Q引物擴增片段位于C虹19: 44055651-44055888,長度為238bp。結果如圖1所示，引物的擴增片段均覆蓋了相應的檢測 位點，無其它同源基因。
[0021] 使用表1中PCR擴增引物分別對檢測樣品進行擴增及Sanger測序，測序結果顯 示，引物擴增片段與XRCC1基因參考序列吻合，結果如圖2所示。使用表1中SNaPshotPCR 引物，SNaPshot法進行檢測，結果如圖3所示。從圖3可知，各產物峰的相對位置及測序反 應滲入的堿基與預期相符，且無其它干擾峰。
[0022] 實施例二XRCCl基因多態性的檢測 提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購自Tiagen，貨號；DP318)的說明書，將DM樣品稀釋至l(K)ng/yL，備用。
[002引 PCR擴增采用Q5?熱啟動超保真2XMasterMix(購自肥B公司，貨號；M049化），反 應體系如表2所示，XRCC1_R399Q的引物濃度為5pmol/uL。PCR擴增反應條件包括；階段1 ; 98°C3min;階段2;98°C10s;階段3;58°C30s;階段4;72°CImin;階段5;返回到階段2， 29個循環；階段6 ;72°C5min;階段7 ;25°C保溫。PCR擴增結束后，取2. 0yLExoSAP-IT (購自Affymetrix，貨號；78205)和3.OuLd地20,混勻，加入PCR擴增產物2.OuL，混勻微 離屯、；在PCR儀中進行酶切反應，程序；37°C，15min;80°C，15min;4°C，保溫。
[0024]采用SNaPshot?MultiplexKit(購自ABI公司，貨號4323151)進行擴增，反應體 系如表3所示，XRCC1_R399Q的引物濃度為5pmol/uL。SNaPshotPCR反應條件包括：階段 1;96°C10s;階段2;55°C5s;階段3;60°C30s;階段4;返回到階段1，25個循環；階段5; 4C保溫。
[00巧]在SNaPshotPCR產物中加入l.OyLSAP酶，按照W下程序進行反應；37°c， 60min;75°C，15min;4°C，保溫。反應完畢后，毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果采用 GE肥MAP陽RIDV4. 1軟件進行分析，確定SNP位點及其基因型，結果如圖3所示。
[0026] 實施例S檢測XRCC1基因多態性的方法的特異性 本檢測方法的特異性定義為陰性符合率。本檢測將XRCC1_R399QG/G基因型的檢出定 義為陰性結果。采用本發明提供的SNaPshot法對9例樣品進行檢測，同時采用ARMS法進 行驗證。SNaPshot法的檢測結果與ARMS法的結果相符，如表4所示。本檢測方法的特異性 為 100〇/〇。
[0027] 實施例四檢測XRCCl基因多態性的方法的靈敏度和準確性 本檢測方法的靈敏度定義為陽性符合率。采用本發明提供的SNaPshot法對19例樣品 進行檢測，同時采用ARMS法進行驗證。SNaPshot測序法的檢測結果與ARMS法的結果相符， 如表5所示。本檢測方法的靈敏度和準確度高。
[002引本檢測WXRCC1_R399Q多態性位點為例驗證本檢測的檢測下限。樣品A與樣品B按1 ;9,2 ;8,3 ;7,4 ;6,5 ;5比例混合后進行檢測，其中，樣品AXRCC1R399Q基因型為A/ A(突變型），樣品BXRCC1R399Q基因型為G/G(野生型）。結果如表6所示，XRCC1基因突 變型與野生型比例為1 ;9(突變型比例為10%)時本檢測方法也能檢測到突變型。XRCC1_ R399Q多態性為胚系突變，在雜合基因型G/A中突變等位基因為50%，因此，本檢測的檢測靈 敏度100%。
[0029] 實施例五檢測XRCCl基因多態性的方法的精密度 本檢測方法的精密度定義為對樣品進行重復檢測得到同一結果的能力。本檢測進行了 人員間、不同時間、不同儀器、同一標本不同孔間的對比實驗，結果如表7a和化所示，所有 結果均顯示一致，本檢測精密度為100%。
[0030] 因此，本發明所提供的引物和檢測方法可作為一種獨立的、應用廣泛的鑒定方法， 解決了XRCC1進行準確分型鑒定的問題，發揮PCR-SNaPshotPCR對所述基因位點基因分型 結果精確、高通量操作的特點，有助于預測銷類藥物化療的預后，減少不良反應，在幫助指 導用藥和個性化治療方面具有重要意義。
[0031] W上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于該些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護范圍。
【主權項】
1. 一種檢測XRCCl基因多態性的引物，其特征在于：包括PCR擴增引物 和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴增引物包括：針對XRCC1_R399Q的上游引物 5' -TCTGACTCCCCTCCAGAIT-3' 和下游引物 5' -GCCCCTCAGATCACACCTA-3' ；所述 SNaPshot PCR 引物包括：針對 XRCC1_R399Q 的 SNaPshot PCR 引物 5' -CGTCGGCGGCTGCCCTCCC-3'。2. -種檢測XRCCl基因多態性的方法，其特征在于：包括如下步驟：A)提取DNA樣品； B)采用權利要求1中所述的PCR擴增引物進行PCR擴增，對擴增產物進行純化；C)采用權 利要求1中所述的SNaPshot PCR引物進行SNaPshot PCR擴增，對擴增產物進行純化；D)毛 細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。3. 根據權利要求2所述的同時檢測XRCC1、ERCC、GSTPl和GSTMl基因多態性的方法， 其特征在于：所述步驟A)中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。4. 根據權利要求2所述的檢測XRCCl基因多態性的方法，其特征在于：所述步驟B)中 的PCR擴增反應條件包括：階段1:98°C 3min;階段2:98°C IOs;階段3:58°C 30s;階段4: 72°〇11^11;階段5:返回到階段2,29個循環；階段6 :721：51^11;階段7:251：保溫。5. 根據權利要求2所述的檢測XRCCl基因多態性的方法，其特征在于：所述步驟C) 中的SNaPshot PCR擴增反應條件包括：階段I :96°C IOs ;階段2 :55°C 5s ;階段3 :60°C 30s ;階段4 :返回到階段1，25個循環；階段5 :4°C保溫。6. 根據權利要求2所述的檢測XRCCl基因多態性的方法，其特征在于：所述步驟D)中， 采用GENEMAPPERID V4. 1軟件對檢測結果進行分析。7. 根據權利要求1所述的檢測XRCCl基因多態性的引物在制備檢測XRCCl基因多態性 試劑中的用途。
【專利摘要】本發明提供一種檢測XRCC1基因多態性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物。本發明屬于生物檢測技術領域，本發明提供的引物可以實現XRCC1基因多態性的特異性檢測，準確性好。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN104988225
【申請號】CN201510384645
【發明人】趙薇薇, 胡昌明, 燕啟江, 郭周萍
【申請人】廣州金域醫學檢驗中心有限公司, 廣州醫科大學
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月30日