快速低成本制備DNA Ladder的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物基因工程領域，尤其是一種快速低成本制備DNA Ladder的方法。
【背景技術】
[0002]DNA ladder是一組已知大小和濃度的DNA片段混合樣品，可以與未知的DNA樣品一起進行凝膠電泳用于初略指示其分子量與濃度，是分子生物學實驗常用的試劑耗材之
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早期的DNA ladder是使用限制性內切酶(如ECOR I或者Hind ΠΙ等)酶切λ噬菌體的基因組DNA或猴病毒細菌的質粒DNA片段而獲得大小不同的DNA片段。這種方法的人力、物力以及儀器維護成本特別高，并且產生DNA片段的大小常常受到限制性酶切位點的限制，不能人工調控DNA ladder的片段大小和濃度。
PCR能夠快速有效地獲得大量目標片段，并且在合適的范圍(100bp-3000bp)內可通過引物設計高效廉價的獲取任意大小的片段，通過將含有目標大小片段構建到PMD18-T載體上，利用載體上的通用引物分別對每個片段進行PCR擴增，DNA ladder的每一個DNA片段再按照設計好濃度進行稀釋與混合，最終快速廉價的制備大小、濃度均可控的DNA ladder。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是:提供一種快速低成本制備DNA Ladder的方法，它解決了傳統酶切方法成本高、獲得DNA片段大小與濃度不可控制的難題，以克服現有技術的不足。
本發明是這樣實現的:快速低成本制備DNA Ladder的方法，根據DNA Ladder所需要的條帶大小，從已知基因組序列中選取目標大小的DNA序列，采用設計好的引物進行PCR進行擴增，切膠回收后將不同大小的條帶分別構建到PMD18-T載體，并提取質粒，獲得各個片段的模板；測定各純化后的目的片段的濃度，按照設計好的濃度進行混合與稀釋，得到最終DNA ladder。
將每個DNA片段的擴增產物進行純化具體是:利用pMDlS-Τ載體上的通用引物M13F與M13R，分別對每一個目的片段進行擴增，通過脫鹽純化PCR產物，獲得各目的片段，利用10 X TE緩沖液溶解，，可以長期保存。
PCR能夠快速有效地獲得大量目標片段，并且在合適的范圍(100bp-3000bp)內可通過引物設計高效廉價的獲取任意大小的片段，
由于采用了以上技術方案，本發明通過PCR擴增的方法獲得DNA Ladder所需要的條帶，所有條帶的大小和濃度都可以精確控制，不受傳統方法(如EcoR I酶切λ DNA)受酶切位點和質粒濃度的限制，生產成本能降低90% ;再通過將含有目標大小片段構建到pMD18-T載體上，利用載體上的通用引物分別對每個片段進行PCR擴增，DNA ladder的每一個DNA片段再按照設計好濃度進行稀釋與混合，最終快速廉價的制備大小、濃度均可控的DNAladder。解決了傳統酶切方法成本高、獲得DNA片段大小與濃度不可控制的難題。而采用本發明方法制造的DNA ladder清晰度與指示效果與商用DNA ladder基本相當，可以代替商用DNA ladder使用。本發明方法簡單，易于實施，成本低廉，使用效果好。
【附圖說明】，
圖1為本發明的流程示意圖；
圖2為本發明的制備DNA ladder與商用DNA ladder的對比圖。
【具體實施方式】，
本發明的實施例:快速低成本制備DNA Ladder的方法步驟一、TlOO?T3000模板的克隆與構建
在Tair數據庫中檢索挑選合適長度的DNA序列，設計擴增引物，以擬南芥幼嫩花cDNA為模板進行PCR擴增，從擬南芥基因組中克隆3000bp、2000bp、1500 bpUOOO bp,750 bp、500 bp,300 bp、100bp 的 DNA 片段，引物組合依次為(DLF+3000R，DLF+2000R，DLF+1000R，DLF+750R，DLF+500R，DLF+300R，DLF+100R)其對應擴增引物序列見序列表，并分別構建到PMD8-T載體，分別命名為T-100?T3000 ;挑選出陽性克隆，并用質粒提取試劑盒(上海生工)制備陽性質粒，具體操作參考示意圖1，序列信息見序列表。
步驟二、T100?T3000快速擴增與純化
采用pMD8-T載體上公用引物M13F和M13R分別對T100?T3000的進行擴增，采用氯仿乙醇純化方法進行脫鹽處理，用10XTE buffer溶解，獲得濃度大、純度高可以長期保存的各個DNA目的片段。
(1)配置PCR反應混合物(上海生工2X Taq PCR反應試劑盒):
2 X Taq PCR Mixture10 μ I
正向引物 Μ13 F (10μΜ ) I μ I 反向引物 Μ13 R (10μΜ) I μ I 質粒 DNA (lOng/μ I) 2 μ I dd H2O6 μ I
每個不同大小的DNA片段分別配制10份。
(2)進行PCR反應，反應的時間和溫度如下:
94°C 3min
94°C 30s，
58°C 30s?3min (根據目標片段長度，I Kb/min)
72°C 30s，40cycles72 °C 5min
(3)純化與溶解:
分別將每個DNA片段的擴增產物收集到一起，加入200 μ I氯仿(國藥)，劇烈振蕩30s，室溫放置5min，12000g，4°C，離心lOmin，取上清至新管中，加入500 μ I無水乙醇，混勾后-20°C放置 20min，12000g，4°C，離心 lOmin，去上清，加入 Iml 75% 乙醇，10000g，5min，4°C，離心 lOmin，去上清，空氣干燥 15min，加 50 μ I 10 X TE buffer 50_60°C溶解 5min ;取I μ I稀釋10倍，測定濃度備用。
步驟三、DNA ladder的混合與檢測
按照DNA ladder所需要的濃度，用10XTE buffer稀釋混合每一個DNA片段；加入溴酚藍使終濃度為lg/L ;取5 μ I與商用DNA ladder 一起電泳，如圖2所示，采用本發明制備的DNA ladder與商用DNA ladder效果相當。
本發明所述并不限于【具體實施方式】中所述的實施例，本領域技術人員根據本發明的技術方案得出其他的實施方式，同樣屬于本發明的技術創新范圍。顯然本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術范圍內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。
【主權項】
1.一種快速低成本制備DNA Ladder的方法，其特征在于:根據DNA Ladder所需要的條帶大小，從已知基因組序列中選取目標大小的DNA序列，采用設計好的引物進行PCR進行擴增，切膠回收后將不同大小的條帶分別構建到PMD18-T載體，并提取質粒，獲得各個片段的模板；采用載體上公用引物大量擴增獲得個目的片段，測定其濃度，按照設計好的濃度進行混合與稀釋，得到最終DNA ladder。2.根據權利要求1所述的快速低成本制備DNALadder的方法，其特征在于:將每個DNA片段的擴增產物進行純化具體是:利用pMD18-T載體上的通用引物M13F與M13R，分別對每一個目的片段進行擴增，通過脫鹽純化PCR產物，獲得各目的片段，利用10 X TE緩沖液溶解。
【專利摘要】本發明提供了一種快速低成本制備DNA Ladder的方法。本發明通過PCR擴增的方法獲得DNA Ladder所需要的條帶，所有條帶的大小和濃度都可以精確控制，不受傳統方法（如EcoR I 酶切λ DNA）受酶切位點和質粒濃度的限制，生產成本能降低90%；再通過將含有目標大小片段構建到pMD18-T載體上，利用載體上的通用引物分別對每個片段進行PCR擴增，DNA ladder的每一個DNA片段再按照設計好濃度進行稀釋與混合，最終快速廉價的制備大小、濃度均可控的DNA ladder。解決了傳統酶切方法成本高、獲得DNA片段大小與濃度不可控制的難題。而采用本發明方法制造的DNA ladder清晰度與指示效果與商用DNA ladder基本相當，可以代替商用DNA ladder使用。
【IPC分類】C12N15/10, C12Q1/68
【公開號】CN104988134
【申請號】CN201510265744
【發明人】李小冬, 于二汝, 舒健虹, 王小利, 莫本田, 蔡一鳴, 吳佳海
【申請人】貴州省草業研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年5月24日