一種芒草wrky轉錄因子在提高植物纖維生物量中的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及芒草WRKY類轉錄因子MlWRKYl2及其編碼基因與應用，屬于植物基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002]芒草(Miscanthus)是一類具有根狀莖的多年生C4植物，多分布于熱帶至亞洲的東南部，是一種開發潛力巨大的纖維類能源植物，南荻(M.1utar1riparia)是我國特有的、在長江流域廣泛分布的高生物產量纖維型多年生能源植物，具有重要的用途，其基因組序列與甜高粱具有較高的序列相似性。
[0003]植物的次生細胞壁是木質纖維素生物質的重要來源，它們也為人類生存提供織物、木材和潛在的第二代生物能源。參與細胞壁(即纖維素、半纖維素和木質素)合成的NAC和MYB轉錄因子在不同物種中都有深入研究，近來發現的擬南芥WRKY轉錄因子被證明參與髓薄壁細胞的次生細胞壁形成相關，可顯著提高植物生物量。WRKY類蛋白共同特點是至少含有一個高度保守的WRKY結構域(WRKYGQK)和C2H2或C2HC的鋅指結構。這類蛋白的WRKY結構域通過結合靶基因啟動子區域的W盒(T)TGACC(A/T)核苷酸序列而調控相應基因的表達，發揮其重要的生物學功能。研究表明，WRKY蛋白參與植物病菌信號轉導、植物衰老、生長發育和非生物逆境等眾多生理過程。
[0004]植物開花是高等植物由營養生長向生殖生長的轉變過程，是個體發育和后代繁衍的中心環節。這一發育的轉變是植物體自身的發育條件和外部環境因素共同決定的。此外，開花時間是在提高生物能源作物的一個重要特征，因為延遲開花可以增加營養生長時間，從而達到提高纖維生物質產量的潛力。
[0005]目前對芒草WRKY轉錄因子的研究尚處于空白，特別是對其調控的遺傳和分子機制還幾乎一無所知。借助擬南芥模式體系，挖掘芒草WRKY家族中調節植物細胞壁增厚及調控植物花期的重要基因資源，對于植物的遺傳改良上具有重要的意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供芒草轉錄因子#7rMT7J?基因的序列及功能，并進一步公開了該基因的應用。
[0007]本發明所提供的芒草WRKY類轉錄因子，命名為M1WRKY12,來源于芒屬植物南荻(.Miscanthus 7wiar1ri/7ariw5.),是具有下述(I)至(3)中任一項所述的核苷酸序列:
(O具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列；
(2)具有編碼序列表中SEQID N0.2的蛋白質序列的多核苷酸；
(3)具有與序列表中SEQID N0.1的DNA序列較高同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；
(4)其中，序列表中的SEQID N0.1由702個堿基組成，編碼一個完整的開放閱讀框，編碼具有序列表SEQ ID N0.2的氣基酸殘基序列的蛋白質。上述編碼基因均具有序列表中SEQ ID N0.1的核苷酸序列。
[0008]上述芒草WRKY轉錄因子的編碼基因MlWRKYl2為如下(I)至(3)是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質:
(O由序列表中的SEQ ID N0.2氨基酸殘基序列組成的蛋白質；
(2)將序列表中的SEQID N0.1氨基酸殘基序列經過一至多個氨基酸殘基經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而形成的具有同等功能的衍生蛋白質；
(3)其中，序列表中的SEQID N0.2由233個氨基酸殘基組成。
[0009]同時，本發明還包含上述芒草WRKY轉錄因子在改變植物生物量、調控植物開花中的應用，及含有本發明基因的表達載體，轉基因植株、重組菌及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
[0010]擴增M/zmrn之中任一片段的引物也在本發明的保護范圍之內。
[0011]本發明還包括所述植物轉錄因子蛋白的亞細胞定位分析。
[0012]本發明還包括所述植物轉錄因子蛋白的應用，包括將含有所述的WRKY蛋白的編碼基因的表達載體轉入擬南芥等其他植物，增強或抑制WRKY蛋白的表達從而調節植物細胞壁的組成，提高或降低生物量，調控開花時間等。
【附圖說明】
[0013]圖1 MlWRKYl2與其他物種WRKY家族轉錄因子保守區的氨基酸序列同源性比對。
[0014]圖2 WRKY轉錄因子氨基酸序列比對后的進化樹。
[0015]圖3 M1WRKY12蛋白亞細胞定位圖。
[0016]圖4 M1VRKY12的表達模式分析。
[0017]圖5 MlWRKYl2恢復擬南芥J tVRKY12的突變表型。
[0018]圖6 MlWRKYl2促進擬南芥早花現象。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明保護范圍不局限于所述內容。
[0020]本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0021 ] 實施例1芒草WRKY家族基因MlWRKYl2的獲得。
[0022]取在14h L/1Oh D光照、溫度25°C、相對濕度60%的條件下培養4周左右的芒草莖段進行基因的克隆分離。利用Trizol法提取其總RNA，利用RT-PCR技術從芒草中分離
之基因的cNDA，其編碼氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0023]本實施例設計的擴增芒草#7rMT7J?基因核心片段的特異性引物為:
正向引物:5’-ATGGAGGGAGGCCAGTTGAG-3’ (SEQ ID N0.3)
反向引物:5’-TCAGAAGGAGCTGAAGCAATC-3’ (SEQ ID N0.4)。
[0024]PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞并測序。
[0025]實施例2之基因序列分析。
[0026]MlWRKYl2基因⑶S序列包含702個核苷酸序列和233個氨基酸序列，預測其分子量為25.7kDa,用DNAMAN軟件分析了 M1WRKY12與其他擬南芥WRKY家族蛋白的同源性。分析結果表明#7rM77J?具有典型保守的C2H2的鋅指結構修飾(圖1)。使用MEGA軟件建立了 MlWRKYl2同其它WRKY家族蛋白的系統發生樹，結果表明MlWRKYl2屬于WRKY-1Ic亞家族，與甜高粱Sb04g033240、穗短柄草&/厥《77￥，水稻flsrMOh擬南芥FMTZJ的親緣關系最近。圖2展不#7腸?Τ/J?蛋白的系統進化關系。
[0027]實施例3麗/厥《77之基因的亞細胞定位。
[0028]將去掉終止密碼子的的的開放閱讀框(ORF)與pB7FWG2載體進行連接，構建與GFP相融合的載體，進行擬南芥轉基因，對T2代轉基因植株進行分析，表明該基因主要在細胞核內表達，如圖3所示。
[0029]實施例4 M1WRKY12的表達模式分析。
[0030]在芒草盛花期，取其根〈root〉、地下莖〈Rhizome〉、基部莖〈stem(B) >、莖尖〈stem(U)〉、葉片〈leaf〉、葉鞘〈sheath〉、花序〈inflorescence〉等進行表達模式分析。利用Trizol法分別提取其總RNA，反轉錄得到第一鏈cDNA。利用qRT-PCR方法檢測芒草
基因在這七個組織中的表達情況。基因用作為內參。如圖4所示，結果表明，基因在地下莖和莖中的表達量較高。
[0031]本實施例設計的qRT-PCR基因核心片段的特異性引物為:
正向引物:5’-CGTGGATGTACTGGATGATGG-3’ (SEQ ID N0.5),
反向引物:5’-CGGAAATAGCTCCTTGGGTG-3’ (SEQ ID N0.6)。
[0032]本實施例設計的基因核心片段的特異性引物為:
正向引物:5’-TGACAGAAGCACCACTAAACCC-3’ (SEQ ID N0.7),
反向引物:5’-CCTGGATGGCGACATACATT-3’ (SEQ ID N0.8)。
[0033]實施例5芒草基因過表達載體的構建。
[0034]先將芒草#7柳沿7之基因全長cDNA連接到pGWC_T載體中，測序正確后，通過基因重組將其插入到Gateway載體pH2GW7中，從而得到含有#7rMT7J?基因的植物過表達載體。
[0035]實施例6在擬南芥的突變體中過量表達#7rMT7J?基因，恢復突變表型在擬南芥中基因缺失突變體表現為髓細胞壁增厚，將基因轉化到擬南芥的突變體中。根據基因功能互補實驗的結果表明，轉化到突變體中飽M1WRKY12基因使髓細胞壁增厚并恢復到了野生型的水平，證明了 MlWRKYl2基因的生物學功能為與髓細胞壁加厚有關，確認了該基因即為與髓細胞壁形成相關的基因。
[0036]利用石蠟切片觀察轉基因擬南芥莖部次生壁的發育情況。具體步驟為:(I)材料的選取及固定:利用鋒利刀片取植株0.2cm左右莖段，置于4%多聚甲醛固定液中真空抽氣2h,直到材料沉于管底，4°C過夜。(2)脫水及透明:1倍PBS清洗一次，乙醇梯度脫水后，利用無水乙醇(A)和二甲苯(B)分別按照4作=3/1^作=1/1^作=1/3，8，8的比例滲透，每步Ih0 (3)浸蠟及包埋:利用二甲苯(B)和石蠟(C)按照8/0=3/1，8/^=1/1，8/^=1/3，(:，(:，〇的比例浸蠟，每步3h，62°C烘箱中進行。(4)切片、展片及烘片:利用LeicaRM2235切片機(Leica公司)將材料切成8 μ m的薄片，置于42°C水浴鍋中展片f 2min，使之吸附于世泰REF188105粘附載玻片(世泰公司)上，37°C烘片2天。(5)脫蠟、二甲苯及染色:將附著有材料的載玻片置于二甲苯中脫蠟5min后，經A(無水乙醇)/B (二甲苯)=1/1，A, A, 95%A, 85%A, 75%A, 50%A, 30%A梯度脫于水中，最后在0.5% TBO染液中染色15s。(7)脫水及封片:將清水洗過的玻片依次在30%A，50%A, 75%A, 85%A, 95%A, A, A, B, B中脫水至二甲苯中，每步30s，隨后利用加拿大樹膠將其封存。(8)切片的觀察:利用OLYMPUS DX51光學顯微鏡(Olympus公司)進行觀察，拍照，如圖5所示。
[0037]實施例7在植物中過量表達#7rMT7J?基因，促進轉基因植株提前開花。
[0038]在#7rMT7J?的超表達植株中，植株表現出早花現象。進一步豐富了人們研究植物春化作用機理和成花過程的手段和內容，同時對于完善和推進植物春化作用機理的研究有著重要的意義。
【主權項】
1.芒草WRKY類轉錄因子全長cDNA，其特征在于: (1)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列； (2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列。2.權利要求1所述芒草WRKY類轉錄因子#7腸《77之基因全長cDNA編碼的WRKY蛋白，其特征在于: (1)SEQID N0.2所示的氨基酸序列序列； (2)SEQID N0.2所示的氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個氨基酸而形成的具有同等功能的蛋白序列。3.含有權利要求1所述的芒草WRKY類轉錄因子#7rMT7J?基因的植物表達載體。4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的表達載體是將所述的WRKY轉錄因子蛋白基因M1WRKY12插入雙元表達載體PB2GW7所得。5.含有權利要求1所述的芒草WRKY轉職子MlWRKYl2基因的亞細胞定位重組載體。6.根據權利要求5所述的亞細胞定位載體，其特征在于所述的表達載體是將所述的WRKY轉錄浪子Μ1.ΚΥ12的CDS序列去掉終止密碼子插入表達載體pB7FWG2所得。7.芒草MlWRKY轉錄因子蛋白基因#7厥《77之的基因工程應用。8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述的芒草WRKY轉錄因子蛋白基因M1WRKY12在通過基因工程手段改變植物細胞壁的組成結構及調控開花時間，培育植物新品種中的應用。
【專利摘要】本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種從芒草（Miscanthus）中分離克隆得到的MIWRKY12基因與植物薄壁細胞增厚及開花調控相關的應用。其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本發明可為提高植物生物量及調控植物花期提供可行方法。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公開號】CN104975028
【申請號】CN201410125344
【發明人】周功克, 賀郭, 于延沖, 胡瑞波, 王華美, 曹英萍, 付春祥
【申請人】中國科學院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月1日