油茶良種長林21號的分子特異性標記引物及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及油茶良種長林21號的分子特異性標記引物及其鑒定方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發展油茶產業，對 保障糧油安全，促進農民增收，推進山區綜合開發和建設社會主義新農村，都具有十分重要 的意義。我國油茶產業方興未艾，發展潛力巨大。目前，我國油茶林總面積達4500多萬畝， 但產量很低，每畝產茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質差或嚴重 退化，而大量的國家和省級審（認）定的優良品種又未推廣應用。同時，一些地方種苗質量 意識淡薄，經營管理粗放。為保障油茶產業又好又快發展，要充分認識油茶良種對發展油茶 產業的重要性，必須加快油茶優良種苗發展和強化質量管理。
[0003] 我國目前對油茶種苗質量的監督管理，主要依靠在管理層面制定的各項制度，而 在技術層面尚未取得關鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術體系。目前通 過國家林木良種審定的12個長林品種系列分別為長林3號、長林4號、長林18號、長林21 號、長林23號、長林26號、長林27號、長林40號、長林53號、長林55號、長林56號、長林 166號。這些油茶良種具有早實豐產、穩產、出籽率高、含油量高、抗性強、適應性廣等特點。 對油茶種苗質量的監督管理要著力解決目前生產上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術層 面上對長林油茶良種進行鑒別保護。
[0004] 目前對油茶品種的鑒別主要依據表觀特征，但由于許多形態性狀鑒定的周期 長、受環境影響大，并且品種數量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀以來， 一些基于PCR的分子標記技術如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增 多態性DNA)、ISSR(Inter_Simple Sequence Repea，簡單序列重復區間擴增多態性）和 SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態性）相繼用于了油 茶的種質資源遺傳多樣性、遺傳距離研宄，但對于分子標記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間 的分子鑒別研宄很少。況且，這些分子標記技術所采用的均為通用引物，其PCR擴增圖譜不 僅復雜、重復性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒別，只有開發出某個品種穩 定、特異的DNA指紋標記才能真正用于該品種的準確快速鑒定。 (三）
【發明內容】
[0005] 本發明目的提供一對特異性高的油茶良種長林21號的分子特異性標記引物，以 及一種能對油茶良種長林21號進行快速鑒定的方法。
[0006] 本發明采用的技術方案是：
[0007] 油茶良種長林21號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下：
[0008] 上游引物：5' -TCACTCTTCAGCAGCTACCCAA-3'，
[0009] 下游引物：5' -CCTTCTCTATCGCTCTCAATCTCG-3'。
[0010] 該引物對是采用PCR技術，經過大量篩選試驗獲得油茶良種長林21號的特異性 DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎設計特異性引物，以該引物對 油茶良種進行PCR擴增，僅長林21號可穩定獲得313bp大小的特異性片段，而其他油茶品 種均不能獲得該特異性片段。需要說明的是，本發明分子特異性標記引物僅限于油茶良種 的鑒別（鑒別其是否為長林21號），即待測樣品僅限于油茶。
[0011] 本發明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林21號進行快 速鑒別的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子 特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現 313bp大小的DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林21號，反之則否；所述分子特異性 標記引物序列為：
[0012] 上游引物：5' -TCACTCTTCAGCAGCTACCCAA-3，，
[0013] 下游引物：5' -CCTTCTCTATCGCTCTCAATCTCG-3'。
[0014] 本發明方法關鍵在于擴增引物的選擇，DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領域常規方法進行。
[0015] 優選的，本發明所述20 μ L PCR反應體系組成如下：
[0016]
[0017] 所述PCR擴增條件如下：94°C預變性7min ;94°C變性45min，60°C退火45s，72°C延 伸2min，共30個循環；最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0018] 具體的，所述方法如下：
[0019] (1)取待測油茶葉片，加液氮磨碎，提取待測油茶的基因組DNA ;所述基因組DNA 提取可利用新型快速植物基因組DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技術有限 公司）進行；
[0020] (2)以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引 物，進行PCR擴增：
[0021] PCR反應體系每20 μ L組成如下：
[0022]
[0023] PCR反應條件如下：
[0024] 94°C預變性 7min ;94°C變性 45min、60°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 個循環；最 后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0025] (3)取步驟⑵擴增產物5 μ L，與1 μ L 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勾，點樣于1. 5 % 的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠 圖像分析儀上照相，若電泳結果出現313bp的DNA條帶，則待測油茶品種為長林21號，反之 則否。
[0026] 本發明有益效果主要體現在：本發明分子特異性標記引物可對油茶良種長林21 號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分 子手段。 (四）
【附圖說明】
[0027] 圖1為對油茶良種進行PCR擴增的結果；M為DNA分子量標準；編號4為油茶良種 長林21號，擴增出了分子量為313bp的特異DNA條帶；其余編號為其它的長林油茶良種， 未見有300bp多大小的特異DNA條帶產生。 (五）
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0029] 實施例1 :
[0030] (1)油茶良種基因組DNA的提取：
[0031] 取待測油茶良種幼嫩葉片0. 03g，加液氮徹底磨碎，基因組DNA的提取利用新型快 速植物基因組DNA提取盒（DP3111，BioTeke，北京百泰克生物技術有限公司），提取獲得油 茶良種的基因組DNA粗提物。DNA粗提物通過1. 5 %的瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光 光度計（Nanodrop Technologies，USA)來檢測完整性、純度及濃度。0D26(i/0D28(i>L8 的 DNA 樣品用于后續PCR擴增。DNA提取物于-20°C冰箱貯藏備用。
[0032] (2)設計特異PCR擴增引物，引物對的序列為：
[0033] 上游引物:5' -TCACTCTTCAGCAGCTA00CM-3,和下游引物:5' -0CTTCTCTAT0GCTCTCMTCT0G -3'，由上海生物工程技術有限公司合成。
[0034] (3) PCR 擴增：
[0035] PCR反應液組成：2 X Power Taq PCR Master Mix (PR1700，BioTeke，北京百泰克生 物技術有限公司）1〇 μ L，10 μ M上下游特異引物對各1 μ L，20ng/μ L模板DNA 3 μ L，CldH2O 5 μ L0
[0036] 擴增反應在Life ECO型擴增儀（Bioer，杭州博日科技有限公司）上進行。
[0037] 擴增條件：
[0038] 94°C預變性 7min;
[0039] 94°C變性 45min、60°C退火 45s、72°C延伸 2min，共 30 個循環；
[0040] 最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
[0041] (4)電泳檢測：取步驟（3) PCR擴增產物5 yL，與I yL 0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻， 點樣于I. 5%的瓊脂糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束后，在含 O.Syg/mL EB的水溶液中染色30分鐘，然后在美國伯樂自動凝膠圖像分析儀（Chemi Doc XRS imaging system，Bi〇-Rad，Hercules，CA，USA)上照相。
[0042] 按照上述方法，分別對多個油茶良種（編號I~12代表油茶良種依次為：1 :長林 3號；2 :長林4號；3 :長林18號；4 :長林21號；5 :長林23號；6 :長林26號；7 :長林27號； 8 :長林40號；9 :長林53號；10 :長林55號；11 :長林56號；12 :長林166號）的特異引物 PCR擴增圖譜進行電泳檢測，結果見圖1。
[0043] 圖1中一條200bp多大小的DNA條帶為所有油茶良種所共有。而箭頭所指為僅從 編號為4的油茶良種長林21號中擴增出了一條清晰明亮、穩定的分子量約為300bp多大小 的特異DNA條帶，其余編號的長林油茶良種，未見有該300bp多大小的特殊DNA條帶產生， 可見本發明分子特異性標記用于油茶良種長林21號的鑒別，其穩定性、特異性非常高。
【主權項】
1. 油茶良種長林21號的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -TCACTCTTCAGCAGCTACCCAA-3'， 下游引物：5' -CCTTCTCTATCGCTCTCAATCTCG-3'。2. -種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對油茶良種長林21號進行快速鑒 定的方法，所述方法為：提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以所述分子特異性 標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測，若電泳結果出現313bp 的特異DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林21號，反之則否；所述分子特異性標記引 物序列為： 上游引物：5' -TCACTCTTCAGCAGCTACCCAA-3'， 下游引物：5' -CCTTCTCTATCGCTCTCAATCTCG-3'。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下：94°C預變性7min ; 94°C變性45min、60°C退火45s、72°C延伸2min，共30個循環；最后于72°C補平7min，終止 溫度為4°C。4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： ⑴取待測油茶葉片，加液氮磨碎，提取待測油茶葉片的基因組DNA ; (2) 以步驟⑴提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR反應體系每20 y L組成如下： 2. Power Taq PCR Master Mix IOuL IOyM上、下游引物 各IyL 20ng/ y L 模板 DNA 3 y L (IdH2O 補足至 20 y L ; PCR反應條件如下： 94°C預變性7min ;94°C變性45min、60°C退火45s、72°C延伸2min，共30個循環；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C ; (3) 取步驟（2)擴增產物5 y L，與I y L0. 25 %溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊脂 糖凝膠上，于IXTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后EB染色，于自動凝膠圖像分 析儀上照相，若電泳結果出現313bp的DNA條帶，則待測油茶品種為長林21號，反之則否。
【專利摘要】本發明涉及一對特異性高的油茶良種長林21號的分子特異性標記引物，以及一種能對油茶良種長林21號進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-TCACTCTTCAGCAGCTACCCAA-3′，下游引物：5′-CCTTCTCTATCGCTCTCAATCTCG-3′。本發明分子特異性標記引物可對油茶良種長林21號進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104975010
【申請號】CN201510297170
【發明人】李海波, 徐梁, 王麗玲, 魏海龍, 胡傳久
【申請人】浙江省林業科學研究院
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年6月2日