一種人類羊膜上皮細胞的分離方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞分離方法，具體涉及一種人類羊膜上皮細胞的分離方法。
【背景技術】
[0002] 羊膜是胚胎發育的產物，是一層光滑、無血管和神經的半透明薄膜，其內側包繞胚 胎，外與絨毛膜相延續，其厚度70~180 um，具有較高的韌性。作為胎盤的一部分，羊膜為 胎兒提供可調節的符合局部運動的空間和適宜環境，通過濾過和物理緩沖作用，分泌營養 因子，保持羊水中水和電解質平衡，抑制母體對胚胎的免疫反應等方式保護發生中的胚胎。
[0003] 羊膜上皮細胞起源于受精后第8天的上胚層細胞（印iblast)，與最終發育成胎兒 的起源相同，并且在發育的時間上早于原腸胚形成，因此理論上講羊膜上皮細胞更好地保 持前原腸胚細胞的可塑性，具有類似胚胎干細胞的生物學特性，其分化能力強，可向三個 胚層分化，并且無致瘤性及倫理學問題。且羊膜上皮不表達人類白細胞抗原HLA-I及HLA- ::，無異體免疫排斥反應[7]，因此適合用于細胞治療。
[0004] 目前廣泛使用的酶解法將羊膜剪碎或者剪成小塊利用胰蛋白酶進行消化，并將消 化產物直接培養獲得羊膜上皮細胞。如CN 104371971 A公開"一種分離獲得羊膜上皮細胞 的方法"，將羊膜組織加入膠原酶溶液孵育；然后將羊膜組織加入胰蛋白酶溶液進行消化； 將上清液離心后獲得羊膜上皮細胞。這種方法會將羊膜上的其他細胞一同分離下來，比如 說羊膜間充質干細胞，從而導致細胞不純，需要進一步純化。從而導致分離步驟繁瑣成功率 低。采用酶解法分離羊膜上皮細胞細胞沒有統一的標準，分離出來的細胞普遍存在活性差、 細胞數量不夠、細胞純度不高、羊膜間充質干細胞和羊膜上皮細胞混雜生長的情況。而由 于兩種細胞的生長特性的差異，混雜培養后由于羊膜間充質細胞分裂能力比羊膜上皮細胞 強，多次傳代培養后，最終因競爭不過而導致羊膜上皮細胞越來越少直至消失。這樣就很難 保證有足夠的數量和純度的羊膜上皮細胞用于研宄。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種人類羊膜上皮細胞的分離方法，能分離得到高純度的羊 膜上皮細胞，且細胞數量多、活性高，為羊膜上皮細胞的研宄和臨床應用奠定基礎。
[0006] 本發明所述的一種人類羊膜上皮細胞的分離方法，包括以下步驟： 第一步，采集運輸胎盤，先將采集到的新鮮胎盤放入盛有〇. 9%質量濃度生理鹽水的無 菌塑料袋中，密封后放入保護盒中；再將保護盒放入溫度為2°C~8°C的運輸箱中，并在12 小時內運輸到細胞分離室；此過程保證了胎盤組織的新鮮及羊膜上皮細胞的活性，為接下 來的分離培養分離提供質量保證。
[0007] 第二步，撕取羊膜，細胞分離人員將接收到的新鮮胎盤放置在圓盤中，先用生理鹽 水沖洗新鮮胎盤表面，再從新鮮胎盤上完整的撕下羊膜； 第三步，沖洗羊膜，先將撕下的羊膜放入腎形盤中展開沖洗，并用止血鉗去除羊膜上的 血絲，再用生理鹽水反復沖洗至少5次，直至羊膜干凈； 第四步，剪裁羊膜，先將沖洗干凈的羊膜剪裁成圓形，圓形直徑大小較相應培養皿直徑 大3~4cm，將圓形的羊膜上皮面朝上覆蓋于培養皿上，并且圓形的羊膜邊緣必須在培養皿 邊緣之上；這樣操作為了確保在接下來的消化過程中胰蛋白酶只單獨接觸羊膜上皮面。
[0008] 第五步，消化羊膜上皮面，將0. 25%質量濃度的胰蛋白酶液加入到覆蓋有羊膜的 培養皿中，直至胰蛋白酶液接近裝滿培養皿，在使羊膜上皮面充分接觸胰蛋白酶同時，羊膜 的其他部位接觸不到胰蛋白酶；在37°C恒溫靜止消化40~80分鐘；消化時間的長短因不 同個體羊膜的厚度、面積等不同而有所變化。
[0009] 第六步，終止消化，消化結束后，先用移液管將培養皿中的胰蛋白酶液吸出并棄 之，再用移液槍加入含10%體積濃度胎牛血清的EMDM-F12培養液(其中的胎牛血清起到終 止殘余的胰蛋白酶的消化作用），并用移液槍吹打培養皿中的羊膜上皮面，使上面的經過消 化的羊膜上皮細胞脫離羊膜進入到細胞培養液中，經過反復吹打直至細胞培養液變的渾 濁，然后，收集細胞培養液置于50ml離心管中；此步驟重復3~5次，以便分離下更多的羊 膜上皮細胞。
[0010] 第七步，離心收集細胞，將收集到的細胞培養液在（Thermo Scientific Sorvall ST16R型號)離心機上，以300~500g離心力（離心力的大小根據液體的粘稠程度在此區間 調整，越黏稠需要的離心力越大）離心5~10分鐘； 第八步，羊膜上皮細胞重懸并接種培養，離心后棄去上清液，離心管底部的羊膜上皮細 胞沉淀用10mlEMDM-F12培養液(含10%體積濃度胎牛血清）重懸，取少量懸液用于細胞計 數、活率檢測以及流式檢測，以I. 〇~I. 3X IOVcm2的密度接種細胞。此時得到的羊膜上皮 細胞的數量可達到IX IO8以上，純度可達到99. 9%以上。
[0011] 本發明分離得到的是高純度的羊膜上皮細胞，且保持著較高的分化潛能。培養的 原代羊膜上皮細胞形態為典型的上皮細胞形態，且培養后沒有出現羊膜間質細胞。分離的 羊膜上皮細胞經流式細胞儀檢測后，細胞純度可達到99. 9%以上，經多次傳代培養后細胞 形態一直保持穩定，而且未出現羊膜間充質干細胞。本發明分離成功率高，形成了一套分 離、培養、檢測的全程質量控制的操作工藝及方法，使羊膜上皮細胞的分離達到標準化要求 且極其有利于產業化。
【附圖說明】
[0012]圖1是將羊膜從胎盤上撕下的圖片； 圖2是將羊膜正面朝上置于塑料培養皿中消化的圖片； 圖3是本發明分離的羊膜上皮細胞原代培養圖片(培養一段時間后看不到間質樣細胞 出現）； 圖4是其他方法分離的羊膜上皮細胞原代培養圖片（培養一段時間后出現間質樣細胞 混雜生長的現象）； 圖5是流式細胞儀檢測本發明分離的羊膜上皮細胞特異性表面抗原SSEA-4,陽性率在 90%以上的曲線圖； 圖6是流式細胞儀檢測本發明分離的羊膜上皮細胞表面抗原CD45為陰性，陰性率在2% 以下的曲線圖； 圖7是流式細胞儀檢測本發明分離的羊膜上皮細胞表面抗原HLA-DR為陰性，陰性率在 2%以下的曲線圖； 圖8是流式細胞儀檢測本發明分離的羊膜上皮細胞表面抗原CD34為陰性，陰性率在2% 以下的曲線圖； 圖9是羊膜上皮細胞裸鼠皮下成骨誘導組織切片圖（阿辛藍染色，箭頭所指為軟骨組 織）； 圖I0是羊膜上皮細胞的成脂分化圖(油紅染色，箭頭所指為脂滴)。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合圖片對對本發明作進一步的說明。
[0014] 所述的一種人類羊膜上皮細胞的分離方法，包括以下步驟： 第一步，采集運輸胎盤，先將采集到的新鮮胎盤放入盛有0. 9%質量濃度生理鹽水的無 菌塑料袋中，密封后放入保護盒中；再將保護盒放入溫度為2°c~8°C的運輸箱中，并在12 小時內運輸到細胞分離室；此過程保證了胎盤組織的新鮮及羊膜上皮細胞的活性，為接下 來的分離培養分離提供質量保證。
[0015] 第二步，撕取羊膜，細胞分離人員將接收到的新鮮胎盤放置在圓盤中，先用生理鹽 水沖洗新鮮胎盤表面，再從新鮮胎盤上完整的撕下羊膜(參見圖1); 第三步，沖洗羊膜，先將撕下的羊膜放入腎形盤中展開沖洗，并用止血鉗去除羊膜上的 血絲，再用生理鹽水反復沖洗至少5次，直至羊膜干凈