一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于單體分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜味劑是指賦予食品或飼料以甜味，提高食品品質(zhì)，滿足人們對(duì)食品需求的食物 添加劑。甜味劑一般具有安全性高、引起味覺良好、穩(wěn)定性高、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)。為改善食 品、藥品的口感，很多物品都要加入適量的甜味劑。而蔗糖是最常用的甜味劑，但蔗糖是含 有最高熱值的碳水化合物，過量攝入會(huì)引起肥胖、動(dòng)脈硬化、高血壓、糖尿病以及齲齒等疾 病。因此積極尋找和開發(fā)新的甜味劑資源成為科學(xué)家們的重要研宄方向。
[0003] 隨著研宄的不斷深入，以甜菊糖苷、甘草甜素為代表的天然甜味劑得到了長(zhǎng)足的 發(fā)展。近年來(lái)，另外一種天然甜味劑成分一一三葉苷也相繼被研宄和開發(fā)，它主要來(lái)源于殼 斗科植物多穗柯甜茶Lithocarpus pachyphyllus(Kurz)Rehd.，結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]
[0005] 《一種含三葉苷的活性分離物及其用途》（申請(qǐng)?zhí)朇N101874824A)報(bào)道了一種高含 量三葉苷活性分離物具有治療糖尿病、糖尿病腎病和肝水腫等疾病?！栋辔蹲钄鄤┑暮?苦味生物堿的消費(fèi)品》（申請(qǐng)?zhí)朇N102065707A)報(bào)道了三葉苷能降低和阻斷由咖啡堿、茶堿 和可可堿等苦味生物堿引起的苦味。隨著科技的發(fā)展，三葉苷的用途會(huì)不斷拓展，但對(duì)于這 樣一個(gè)優(yōu)良的天然甜味劑，應(yīng)該如何大量制備分離，目前國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，旨在解決現(xiàn)有天 然甜味劑分離效率較低、未能實(shí)現(xiàn)大量制備分離的問題。
[0007] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明提供一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，包括 如下步驟：
[0008] (1)將粉碎后的三葉苷原料以固液質(zhì)量比1 :10~50加入體積分?jǐn)?shù)為30~90% 的乙醇，加熱回流分離，分離液過濾，分離出濾渣和濾液；
[0009] (2)將濾渣按步驟（1)所述分離方法重復(fù)分離2次，合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味， 得分離物；
[0010] (3)將1質(zhì)量份步驟⑵中的分離物加入100質(zhì)量份水溶解，并用乙酸乙酯萃取， 萃取液減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏；
[0011] (4)將所述步驟（3)中的乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色譜法分離得到天然甜味 劑；其中，高速逆流色譜法中的溶劑系統(tǒng)由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水按體積比1 :6 :2~ 3 :6組成，該溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相。
[0012] 優(yōu)選地，所述三葉苷原料包括多穗柯甜茶。
[0013] 優(yōu)選地，所述的高速逆流色譜分離過程中，主機(jī)轉(zhuǎn)速750~850rpm/min，流動(dòng)相流 速為 1. 5 ~2. 5mT ,/mi η 〇
[0014] 相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0015] (1)本發(fā)明分離方法簡(jiǎn)便、快捷，分離周期短。傳統(tǒng)的柱色譜方法操作繁瑣，需要反 復(fù)的進(jìn)行柱層析分離，分離周期長(zhǎng)，一般需要幾個(gè)月的時(shí)間。采用本方法，只需3~4天即 可，大大縮短了分離時(shí)間。
[0016] (2)本發(fā)明單體制備量大。根據(jù)所需三葉苷的質(zhì)量，可以調(diào)節(jié)被分離樣品的進(jìn)樣 量，制備型高速逆流色譜儀一次性可以分離出幾百毫克甚至克級(jí)的三葉苷。
[0017] (3)本發(fā)明分離出的三葉苷單體化合物具有多種藥理活性，在保健食品和藥品領(lǐng) 域具有廣闊的應(yīng)用前景，本方法提供了實(shí)現(xiàn)天然甜味劑三葉苷產(chǎn)業(yè)化制備的物質(zhì)基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中高速逆流色譜分離三葉苷的色譜圖；
[0019] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中分離到的三葉苷的高效液相檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明提供一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，包括如下步驟：
[0022] (1)制備多穗柯甜茶提取物：
[0023] 取經(jīng)干燥的多穗柯甜茶葉，樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎。稱取多穗柯甜茶粉末，加入10~ 50倍重量的體積分?jǐn)?shù)為30~90%的乙醇溶液中，回流提取2~4h，過濾；將濾渣重復(fù)上述 步驟，再提取2次，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得多穗柯甜茶提取物。
[0024] (2)提取物的進(jìn)一步純化：
[0025] 將上述步驟制得的多穗柯甜茶提取物加適量水混懸后，放入分液漏斗中，同時(shí)加 入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮干燥，即得乙酸乙酯粗分 離物。
[0026] (3)高速逆流色譜分離乙酸乙酯萃取物中的三葉苷：
[0027] A、溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的配制
[0028] 在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水兩相溶劑體系，其體積比為1 :6 : 2~3 :6,充分振搖后在室溫下靜置過夜。使用前分別取分液漏斗中的上相作為HSCCC的固 定相，下相作為HSCCC的流動(dòng)相，超聲脫氣30min。取步驟（2)中的乙酸乙酯萃取物，用相同 體積的上相和下相溶解樣品，備用。
[0029] B、高速逆流色譜分離制備過程
[0030] 首先將溶劑系統(tǒng)的上相注入高速逆流色譜儀分離管中，待上相充滿整個(gè)管路后調(diào) 整主機(jī)轉(zhuǎn)速750~850rpm/min，再以1. 5~2. 5mL/min流速泵入下相，待流動(dòng)相從柱出口 流出，兩相在分離管中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入a中的樣品溶液。在280nm波長(zhǎng)下檢 測(cè)，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖收集三葉苷流分。
[0031] C、三葉苷的分析和鑒定
[0032] 使用高效液相色譜對(duì)b中分離得到的三葉苷流分進(jìn)行純度檢測(cè)：應(yīng)用Hypersil C18色譜柱，甲醇-水（20 :80，v/v)為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，測(cè)得三葉苷流分為 單一峰，純度高于98 % ;使用IH NMR和13C NMR對(duì)三葉苷流分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，核磁數(shù)據(jù)見 表1。
[0033] 表 1 三葉苷的 IH NMR 和 13C NMR 數(shù)據(jù)（DMS0-d6)
[0034]
[0035]
[0036] 更具體如下實(shí)施例所述。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] (1)制備多穗柯甜茶提取物：
[0039] 取經(jīng)干燥的多穗柯甜茶葉，樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎。稱取多穗柯甜茶粉末500g，加入 20倍重量的體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液中，回流提取3h，過濾；將濾渣重復(fù)上述步驟，再提 取2次，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得多穗柯甜茶提取物45. 6g。
[0040] (2)多穗柯甜茶提取物的進(jìn)一步純化：
[0041] 取步驟（1)制得的多穗柯甜茶提取物20g加適量水混懸后，放入分液漏斗中，同時(shí) 加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取500mL，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮干燥，即 得乙酸乙酯萃取物8. 3g。
[0042] (3)高速逆流色譜分離乙酸乙酯粗分離物中的三葉苷：
[0043] a.溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的配制
[0044] 在分液漏斗中配制正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水兩相溶劑體系，其體積比為1 :6 : 2 :6,振搖30s后在室溫下靜置過夜。使用前分別放出上相和下相，使用超聲波提取器脫氣 30min。取步驟（2)中的乙酸乙醋萃取物130mg，用相同5mL的上相和5mL的下相溶解樣品， 備用。
[0045] b.高速逆流色譜分離制備過程
[0046] 首先將溶劑系統(tǒng)的上相快速（9. 99mL/min)注入高速逆流色譜儀分離管中，待上 相充滿整個(gè)管路后調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速850rpm/min，再以I. 5mL/min流速泵入下相，待流動(dòng)相從 柱出口流出，兩相在分離管中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥注入a中的樣品溶液。在280nm波 長(zhǎng)下檢測(cè)，記錄色譜圖，根據(jù)色譜圖收集三葉苷流分。高速逆流色譜圖見圖1。
[0047] c.三葉苷的分析和鑒定
[0048] 使用高效液相色譜對(duì)b中分離得到的三葉苷流分進(jìn)行純度檢測(cè)：應(yīng)用Hypersil C18色譜柱，甲醇-水（20 :80，v/v)為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，測(cè)得三葉苷流分為 單一峰，純度高于98. 4%，高效液相色譜檢測(cè)圖見圖2。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] (1)制備多穗柯甜茶提取物：
[0051] 取經(jīng)粉碎機(jī)粉碎的多穗柯甜茶粉末200g，加入50倍重量的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙 醇溶液中，回流提取2. 5h，過濾；將濾渣重復(fù)上述步驟，再提取2次，合并濾液，減壓濃縮至 浸膏狀，得多穗柯甜茶提取物21. 4g。
[0052] (2)多穗柯甜茶提取物的進(jìn)一步純化：
[0053] 取步驟（1)制得的多穗柯甜茶提取物IOg加適量水混懸后，放入分液漏斗中，同時(shí) 加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取400mL，萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮干燥，即 得乙酸乙酯萃取物4. 2g。
[0054] (3)高速逆流色譜分離乙酸乙酯萃取物中的三葉苷：
[0055] 高速逆流色譜分離乙酸乙酯萃取物中的三葉苷，具體操作方法詳見實(shí)例1。使用體 積比為1 :6 :3 :6的正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水溶劑系統(tǒng)，在主機(jī)轉(zhuǎn)速為800rpm/min，流速 為I. 8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm條件下，從95mg乙酸乙醋粗分離物中經(jīng)高速逆流色譜分離 得到純度為98. 7 %的三葉苷31. 4mg。
[0056] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將粉碎后的三葉苷原料以固液質(zhì)量比1 :1〇~50加入體積分?jǐn)?shù)為30~90%的乙 醇，加熱回流分離，分離液過濾，分離出濾渣和濾液； (2) 將濾渣按步驟（1)所述分離方法重復(fù)分離2次，合并濾液，減壓濃縮至無(wú)醇味，得分 離物； (3) 將1質(zhì)量份步驟（2)中的分離物加入100質(zhì)量份水溶解，并用乙酸乙酯萃取，萃取 液減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏； (4) 將所述步驟（3)中的乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色譜法分離得到天然甜味劑；其 中，高速逆流色譜法中的溶劑系統(tǒng)由正己烷、乙酸乙酯、乙醇和水按體積比1 :6 :2~3 :6組 成，該溶劑系統(tǒng)的上相為固定相，下相為流動(dòng)相。2. 如權(quán)利要求1所述的大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，其特征在于，所述三葉苷 原料包括多穗柯甜茶。3. 如權(quán)利要求2所述的大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，其特征在于，所述的高速 逆流色譜分離過程中，主機(jī)轉(zhuǎn)速750~850rpm/min，流動(dòng)相流速為1. 5~2. 5mL/min。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種大量分離天然甜味劑三葉苷的方法，通過將粉碎后的三葉苷原料以固液質(zhì)量比1：10～50加入體積分?jǐn)?shù)為30～90％的乙醇，加熱回流分離，分離液過濾，分離出濾渣和濾液，將濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，得分離物；將分離物加水溶解，并用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮得乙酸乙酯浸膏；將乙酸乙酯浸膏采用高速逆流色譜法分離，得到天然甜味劑。本發(fā)明分離方法簡(jiǎn)便、快捷，分離周期短，單體制備量大，且單體具有多種藥理活性。
【IPC分類】C07H15/203, C07H1/08
【公開號(hào)】CN104974201
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510358050
【發(fā)明人】孫印石, 張玉偉
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年6月25日