Pgⅱ與mbp融合蛋白的可溶性分泌表達及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種重組PGII的融合蛋白可溶性分泌 表達及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 胃蛋白酶原（Pepsinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的酶前體，在pH1-5的酸性條件 下轉化成有活性的胃蛋白酶。根據其生化特性和免疫原性可將其分為2個亞群，組分1-5的 免疫原性相同，稱為PGI(又稱PGA)，主要由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌；組分6和7 被稱PGII(又稱為PGC)，除了由胃底腺的主細胞和黏液頸細胞分泌外，賁門腺和胃竇的幽 門腺的黏液頸細胞以及十二指腸上段也能產生PGII。
[0003] 正常情況下，胃粘膜產生的胃蛋白酶原大部分進入胃腔，酸化后活化成胃蛋白酶， 對蛋白質進行消化，約有1%的PG透過胃黏膜毛細血管進入血液循環。血清PGI和PGII 反映胃黏膜腺體和細胞的數量，也間接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。當胃黏膜發生病 理變化時，血清PG含量也隨之改變。因此，監測血清中PG的濃度可以作為監測胃黏膜狀態 的手段。
[0004] 血清PG水平反映了不同部位胃粘膜的形態和功能：PGI是檢測胃泌酸腺細胞功能 的指針，胃酸分泌增多PGI升高，分泌減少或胃粘膜腺體萎縮PGI降低；PGII與胃底粘膜 病變的相關性較大（相對于胃竇粘膜），其升高與胃底腺管萎縮、胃上皮化生或假幽門腺化 生、異型增值有關；PGI/II比值進行性降低與胃粘膜萎縮性進展相關。因此聯合測定PGI和 PGII比值可起到胃底腺粘膜"血清學活槍"的作用。
[0005] 胃蛋白酶原是分子量為42KDa的單鏈多肽，含有3個連續的二硫鍵，在原核表達系 統中胞內表達很難正確折疊，蛋白以無活性的包涵體形式存在，復性后活性很低。本發明利 用malE天然信號肽將PGII引導至大腸桿菌周至，實現了PGII蛋白的可溶性分泌表達， 重組表達的PGII蛋白具有很好的免疫原性，本發明中的PGII蛋白的N端融合了MBP蛋 白，其在提高PGII融合蛋白表達量的同時還改善了PGII蛋白不穩定容易降解的特性。
[0006] 目前，人胃蛋白酶原主要從人胃組織中提取，來源有限，成本高昂，很難實現產業 化，所以重組表達高活性的胃蛋白酶原具有很好的市場前景。
【發明內容】
[0007] 本發明公開一種利用大腸桿菌表達系統分泌表達重組人PG II融合蛋白的方法； 同時還提供了該融合蛋白的制備方法。
[0008] 本發明還公開了使用上述方法獲得的PGII融合蛋白在制備PGII的單克隆抗體 中作為免疫原，以及在胃蛋白酶原診斷試劑中的應用。
【附圖說明】
[0009] 圖1.本發明的包含PGII基因的重組質粒載體構建圖；
[0010] 圖2.本發明的重組表達PGII融合蛋白的表達及純化SDS-PAGE電泳圖；
[0011] 圖3.本發明純化獲得的融合蛋白經FactorXa酶切的SDS-PAGE電泳圖；
[0012] 圖4.本發明制備的融合蛋白作為免疫原所制備的PGII單抗的效價；
[0013] 圖5.本發明制備的融合蛋白的PGII活性檢測。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1:PGII編碼序列的擴增
[0015] 使用PCR方法從質粒PET32a-PGII(本公司構建）擴增出PGII的編碼序列，所 用的引物PGC5的5'端添加了BamHI的酶切位點，引物PGC3的5'端添加了Hindlll的酶 切位點。
[0016] PGC5 :5'-aagggatccggtagcggctctggctcgggttctggcgcagttgtcaaggttcctttga ag-3'
[0017] PGC3 ： 5? -aagaagcttttagtggtggtggtggtggtggtggtgagcagcggtagcaaatccgac-3?
[0018] 100y1的PCR反應體系中加入1y1的LaTaqDNA聚合酶（TaKaRa)，10yM的 PGC5和PGC3各4y1，2. 5mM的dNTP加入8y1，10XPCR反應緩沖液加入10y1。PCR的反 應條件為：94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，57 °C退火30秒，72 °C延伸1分鐘30秒，然后 回到預變性，共進行25個循環，最后延伸7分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物中的 目的條帶，然后將目的條帶切下，溶膠回收。
[0019] 實施例2 :MBP-PGII融合蛋白表達載體的構建
[0020] 取2yg實施例1中PCR擴增得到的PGII編碼序列，建立50yl的雙酶切體 系，具體如下：2yg的PGII編碼序列，5yl的10XK酶切反應緩沖液，1. 5ylBamHI和 1. 5y1的HindIII，加雙蒸水至總體積50y1，37°C水浴中反應6小時。使用凝膠回收試劑 盒（OMEGABI0-TEK)純化PGII編碼序列的雙酶切產物。
[0021] 取600ng的pMAL-p2X(NEB公司）載體，建立50y1的雙酶切體系，具體如下：600ng 的pMAL-p2X載體，5y1的10XK酶切反應緩沖液，1. 5y1BamHI的和1. 5y1的Hindlll， 加雙蒸水至總體積50y1，37°C水浴中反應6小時。使用凝膠回收試劑盒（OMEGABIO-TEK) 純化pMAL-p2X載體雙酶切產物。
[0022] 連接反應：取4y1經過純化的pMAL-p2X的BamHI和Hindlll雙酶切產物，加入 6y1經過純化的PGII的雙酶切產物，1y1的T4DNA連接酶（TaKaRa)和1y1的10XT4 DNA連接酶反應緩沖液，16°C水浴中連接過夜。
[0023] 連接產物轉化大腸桿菌DH5a，然后挑取克隆，送公司測序（感受態DH5a的制備 方法及轉化方法依照"分子克隆實驗指南"第二版所述。J.薩姆布魯克著）。所得重組質 粒命名為pMAL-PGII。
[0024] 實施例3 :MBP_PGII融合蛋白的表達
[0025] 將所獲得的pMAL-PGII質粒轉化E.coliBL21 (DE3) (Novagen公司）感受態細胞。 細菌的誘導表達：挑取克隆接種于l〇〇ml含100yg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中，在 37°C、250rpm條件下培養過夜，制備種子液。
[0026] 取10ml種子液接種入裝有1LLB-Amp培養基的3L錐形瓶，37°C培養至0D_為 0. 5左右，然后加入終濃度為0. 5mM的IPTG，將溫度降為28°C誘導8h后，12000g離心獲得 菌體。制備全菌電泳樣品，蛋白電泳分析目的蛋白表達情況。SDS-PAGE電泳的樣品制備方 法、電泳電壓、凝膠染色和脫色的方法見"分子克隆實驗指南"第二版所述。J.薩姆布魯克 著。
[0027] 實施例4 :含有MBP-PG II基因的大腸桿菌的周至蛋白抽提
[0028] 高滲溶液處理菌體：加入1/10菌液體積高滲液（20mMTris、20% (W/V)鹿糖、ImM EDTA，pH8. 0)，重懸菌體，冰上放置10分鐘，12000g離心15分鐘，收集上清；
[0029]低滲濃液處理菌體：加入1/10菌液體積低滲液（0.ImMMgCl2)，重懸菌體，冰上放 置10分鐘，12000g離心15分鐘，收集上清。
[0030] 實施例5 :MBP-PGII融合蛋白的純化
[0031] 1)QFF純化蛋白：高、低滲處理液混合后上樣，用5-10個柱體積的Elution Buffer(20mMTris、lMNaCl)洗脫蛋白；
[0032] 2)HiTrapChelatingHP(鎳離子螯合親和柱，GE)純化蛋白：上樣后，先用Wash Buffer(20mMTris，0.5MNaCl、80mMimidazole，pH8.0)沖洗掉雜蛋白，然后用Elution Buffer(20mMTris，0.5MNaCl、300mMimidazole，pH8.0)洗脫目的蛋白。
[0033] 實施例6 :MBP_PG II融合蛋白酶切鑒定
[0034] 制備的MBP-PGII融合蛋白具有FactorXa的酶切位點，用FactorXa對獲得的融 合蛋白進行酶切鑒定，具體酶切方法：MBP-PGII融合蛋白與FactorXa質量比為50 : 1， 酶切緩沖液（20mMTris，100mMNaCl、2mMCaCl2,pH8. 0)，23°C，酶切 6h。用上述方法可以 去除BMP標簽蛋白，制備天然大小的PGII重組蛋白。
[0035] 實施例7 :MBP_PG II融合蛋白免疫小鼠，制備單克隆抗體
[0036] 1)免疫小鼠：制備的重組MBP-PGII融合蛋白按每只小鼠100yg蛋白量與弗氏 完全佐劑等體積混勻乳化，皮下免疫；3周后，二次免疫，50yg蛋白量與弗氏不完全佐劑等 體積混勻，乳化后，腹腔注射免疫；2周后，三次免疫，方法同二次免疫；7天后，采尾靜脈血 檢測，效價大于24W。
[0037] 2)單克隆抗體制備：取免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，進行HAT 選擇性培養，利用ELISA方法篩選出陽性細胞株，進行三次單克隆化培養，得到穩定分泌抗 體的單克隆細胞株，將每株單克隆抗體雜交瘤細胞株進行擴大培養后，制備腹水。
[0038] 3)抗體純化及效價檢測：采集的腹水經過proteinA柱純化，獲得高純的小鼠單 抗蛋白。分別包被5ug/mlMBP-PG11融合蛋白和MBP蛋白，利用ELISA檢測制備的腹水抗 體效價。
[0039] 實施例8 :MBP_PG II融合蛋白免疫原性檢測
[0040]MBP-PGII融合蛋白340ng/ml為起始檢測濃度，連續對半稀釋，用PGII免疫比濁 試劑（九強生物公司）定量不同濃度融合蛋白的PGII含量。
【主權項】
1. 一種人PG II融合蛋白的原核表達質粒的構建，其特征是將PG II的基因通過表達 質粒pMAL-p2X或pMAL-p5X導入大腸桿菌表達菌株，IPTG誘導PG II融合蛋白分泌至大腸 桿菌的周至內從而獲得可溶性表達。2. 權利要求1所述的表達質粒，其特征是質粒包含Ptac啟動子-maleE信號肽-malE 基因-FactorXa酶切位點-PG II基因_8XHis Tag的序列。3. -種利用權利要求1-2所述的重組質粒表達大腸桿菌周至腔來源的MBP-PG II的 融合蛋白，其特征在于PG II的genebank號為J04443. 1，融合蛋白具有序列表中SEQ ID No 1氨基酸序列；或者是將融合蛋白的氨基酸殘基在不改變融合蛋白特性的前提下，進行 部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到重組蛋白。4. 根據權利要求1-3所述的表達載體中含有maleE蛋白天然信號肽，用于MBP-PG II 的分泌表達，其特征在于信號肽具有序列表中SEQ ID No 2氨基酸序列。5. 根據權利要求1-4所述的重組表達的PG II融合蛋白，其N端融合BMP蛋白，用以提 尚融合蛋白表達量及穩定融合蛋白。6. -種利用權利要求1-5任一項所述的表達質粒導入表達的宿主菌包括以下大腸桿 菌工程菌株：DH5a、T0P10、TB1 和 BL21。7. -種權利要求1-6所述重組可溶性表達PG II的融合蛋白的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟： (1) 篩選高效表達MBP-PG II融合蛋白的菌株； (2) 將陽性菌株用LB培養基培養，IPTG誘導獲得含有MBP-PG II融合蛋白的菌液； (3) 離心收集菌體，高低滲溶液處理菌體，抽提周至蛋白； (4) 陰離子交換層析柱和金屬離子螯合親和層析柱純化融合蛋白。8. -種權利要求1-7制備得到的PG II融合蛋白在制備PG II的單克隆抗體中作為免 疫原，以及在胃蛋白酶原診斷試劑中的應用。
【專利摘要】本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種人胃蛋白酶原II(PG II)與麥芽糖結合蛋白(MBP)的融合蛋白在大腸桿菌中的可溶性分泌表達；提供了該融合蛋白的制備方法。本發明還公開了上述重組BMP-PG II融合蛋白在制備單克隆抗體，胃蛋白酶原II試劑盒校準品中的應用。本發明利用了Ptac啟動子、malE信號肽、麥芽糖結合蛋白等元件實現了PG II在大腸桿菌周至內的可溶性分泌表達，不僅大大提高了來自原核表達系統的重組人PG II蛋白的免疫原活性，并且有效的降低了重組PG II的制備成本。
【IPC分類】G01N33/573, C07K16/40, C07K19/00, G01N33/577, C12N15/70, C12R1/19
【公開號】CN104962573
【申請號】CN201510399896
【發明人】孔毅榮, 于海雙, 李小紅
【申請人】北京嘉萬生物技術有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月8日