斯氏艾美耳球蟲體內表達外源基因的一種rna轉染系統的制作方法
【專利說明】
[0001]技術領域:
本發明公開了斯氏艾美耳球蟲病毒的核酸序列，及一種以斯氏艾美耳球蟲病毒RNA為載體的外源基因在斯氏艾美耳球蟲體內表達的轉染系統，屬于基因工程領域。
[0002]【背景技術】:
兔球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的一種寄生性原蟲病。已經報道的感染家兔的艾美耳屬球蟲有17種，其中斯氏艾美耳球蟲Es)的致病力最強、危害最大。它寄生于兔的肝膽管上皮細胞，能引起嚴重的肝球蟲病，對養兔業的危害最大。長期以來，兔球蟲病主要依靠化學藥物進行治療，由于球蟲極易產生耐藥性，給藥物防治也帶來了困難。其主要原因就是缺乏一種研宄斯氏艾美耳球蟲細胞和分子生物學特征的基因工程工具。早在1989年就已報道在斯氏艾美耳球蟲體內觀察到了病毒粒子的存在，但目前仍未見關于斯氏艾美耳球蟲病毒核酸序列及以斯氏艾美耳球蟲病毒RNA為載體的轉染系統的報導。
[0003]
【發明內容】
:
本發明所述的一種斯氏艾美耳球蟲病毒的核酸序列，基因序列如SEQ n0.1所示，其全長為6219bp，含有2個開放閱讀框(open reading frames (ORF))，之間有四個堿基的重疊。其開放閱讀框前39Ibp為5’非編碼區，第392bp到279Ibp為ORFl，編碼800個氨基酸的衣殼蛋白，理論相對分子量為86.471 kDa。第2788bp到6090bp為0RF2，編碼1101個氨基酸的RNA依賴RNA聚合酶蛋白，理論相對分子量為118.850 kDa。第6091bp到6219bp為3’非編碼區。
[0004]本發明所述的一種斯氏艾美耳球蟲病毒轉染載體，該轉染系統含有多克隆酶切位點，方便外源基因轉入斯氏艾美耳球蟲體內，對其基因表達調控、基因功能及生化代謝等特征的研宄。
[0005]本發明所述的一種斯氏艾美耳球蟲病毒轉染載體的構建方法，包括以下步驟:
1)通過PCR擴增在5’非編碼區前端引入T7啟動子，將含有外源基因和多克隆酶切位點的基因序列替換斯氏艾美球蟲病毒基因組的部分編碼區；
2)應用T7 RiboMAX (TM) Express Large Scale RNA Product1n System 進行體外轉錄;
3)將體外轉錄的RNA電穿孔至斯氏艾美耳球蟲未孢子化卵囊內進行外源基因的表達。
[0006]本發明的有益效果在于:
提供了斯氏艾美耳球蟲病毒基因組dsRNA全長cDNA序列6219bp。所構建的轉染系統含有多克隆酶切位點，方便外源基因在斯氏艾美耳球蟲體內的表達。該病毒轉染系統的構建，為研宄斯氏艾美耳球蟲基因功能和生物學特性提供了有利的工具。
[0007]【附圖說明】:
圖1A，圖1B，圖1C分別為含綠色熒光蛋白(EGFP)的EsRVl RNA轉染載體的構建，含紅色熒光蛋白(RFP)的EsRVl RNA轉染載體的構建，含綠色熒光蛋白(EGFP)及紅色熒光蛋白(RFP)的EsRVl RNA轉染載體的構建；
圖2 A，圖2B，圖2C為本發明檢測綠色熒光蛋白及紅色熒光蛋白在球蟲體內的表達。
[0008]【具體實施方式】:
通過以下實施例進一步舉例描述本發明，并不以任何方式限制本發明。下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于此。
[0009]實施例1
含綠色熒光蛋白(EGFP)的斯氏艾美耳球蟲病毒RNA轉染載體的構建
如附圖1A所示，根據斯氏艾美耳球蟲病毒(EsRVl)基因組dsRNA的序列特征，將綠色焚光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因替換 dsRNA 的第 452 位到5985位核酸序列，構建EsRVl與EGFP的轉染載體。用PCR擴增反應將T7啟動子引入到dsRNA cDNA的5’非編碼區的前端的同時，用PCR方法從EsRVl dsRNA cDNA擴增EsRVl的5’ 端 451bp (包括 5’ UTRs)，3’端 234bp (包括 3’ UTRs)及從實驗室保存的 pMD18-T_Green質粒擴增EGFP編碼區序列(717bp)。將三個片段分別克隆到pMD18-T載體上，得到重組質粒pEsRV451-EGFP-pEsRV234。重組質粒 pEsRV451_EGFP_pEsRV234 經 PCR 擴增后，PCR 產物凝膠回收，定量后作為模板，用 T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Product1n System進行體外轉錄。每管20μ?反應液包括:RiboMAX? Express T7 2XBuffer 10μ?，PCR純化產物 8μ?，Τ7 Enzyme Mix 2μ?。37°C 反應 30min，加 IyL DNase 消化 DNA 模板，電泳觀察轉錄結果后，在BTX電轉杯中加入20μ? pEsRV451-EGFP-pEsRV234體外轉錄體RNA、5(^L未孢子化卵囊(I X 15個)和30μ? Cytomix溶液，冰浴15min后進行電轉化。電轉化條件為:電壓500V、脈沖時間0.3ms間隔10ms連續進行三次電擊反應。之后冰浴20min，將未孢子化卵囊轉移至24孔板中，加入適量的重鉻酸鉀，于28.5°C溫箱中進行孢子化。提取pEsRV451-EGFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此為模板進行RT-PCR擴增EGFP基因。同時提取孢子化后的蟲體蛋白進行Western blot分析。結果均可檢測到綠色熒光蛋白的表達(見附圖2A)。說明可以利用斯氏艾美耳球蟲病毒作為一種轉染載體，攜帶外源基因在其體內表達。
[0010]實施例2
含紅色熒光蛋白(RFP)的斯氏艾美耳球蟲病毒RNA轉染載體的構建
如附圖1B所示，根據斯氏艾美耳球蟲病毒(EsRVl)基因組dsRNA的序列特征，將紅色焚光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因替換dsRNA的第452位到5985位核酸序列，構建EsRVl與RFP的嵌合體。用PCR擴增反應將T7啟動子引入到dsRNA cDNA的5’非編碼區的前端的同時，用PCR方法從EsRVl dsRNA cDNA擴增EsRVl的5’端451bp (包括5’ UTRs)，3’端234bp (包括3’ UTRs)及從實驗室保存的pMD18_T-Red質粒擴增RFP編碼區序列(675bp)。將三個片段分別克隆到PMD18-T載體上，得到重組質粒pEsRV451-RFP-pEsRV234。重組質粒 pEsRV451_RFP_pEsRV234 經 PCR 擴增后，PCR 產物凝膠回收，定量后作為模板，應用 T7 RiboMAX? Express Large Scale RNA Product1n System進行體外轉錄。將pEsRV451-RFP-pEsRV234體外轉錄體RNA加入斯氏艾美耳球蟲未孢子化卵囊Cytomix溶液中，終體積為100 μ I,使用BTX電轉杯，以電壓500V、脈沖時間0.3ms間隔10rns連續進行三次電擊反應。冰浴20min之后，將未孢子化卵囊轉移至24孔板中，加入適量的重鉻酸鉀，于28.5°C溫箱中進行孢子化。提取pEsRV451-RFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此為模板進行RT-PCR擴增RFP基因。同時提取孢子化后的蟲體蛋白進行Western blot分析。結果均可檢測到紅色熒光蛋白的表達(見附圖2B)。說明可以利用斯氏艾美耳球蟲病毒作為一種轉染載體，攜帶外源基因在其體內表達。
[0011] 實施例3
含綠色熒光蛋白(EGFP)及紅色熒光蛋白(RFP)的斯氏艾美耳球蟲病毒RNA轉染載體的構建
如附圖1C所示，根據斯氏艾美耳球蟲病毒(EsRVl)基因組dsRNA的序列特征，將綠色熒光蛋白(EGFP)基因替換dsRNA的第452位到2719位核酸序列，將紅色熒光蛋白(RFP)基因替換dsRNA的第2871位到5985位核酸序列，構建EsRVl與GFP及RFP的嵌合體。用PCR擴增反應將T7啟動子引入到dsRNA cDNA的5’非編碼區的前端的同時，用PCR方法從EsRVldsRNA cDNA 擴增 EsRVl 的 5’端 451bp (包括 5’UTRs)，3’端 234bp (包括 3’UTRs)，EGFP 編碼區及RFP編碼區四個片段，構建EsRVl與GFP及RFP的嵌合體，并分別克隆到pMD18_T載體上，得到重組質粒 pEsRV451-EGFP-RFP-pEsRV234。重組質粒 pEsRV451_EGFP-RFP_pEsRV234經PCR擴增后，PCR產物凝膠回收，定量后作為模板，應用T7 RiboMAX? Express LargeScale RNA Product1n System 進行體外轉錄。將 pEsRV451_EGFP-RFP_pEsRV234 體外轉錄體RNA加入斯氏艾美耳球蟲未孢子化卵囊Cytomix溶液中，終體積為100 μ 1，使用BTX電轉杯，以電壓500V、脈沖時間0.3ms間隔10ms連續進行三次電擊反應。冰浴20min之后，將未孢子化卵囊轉移至24孔板中，加入適量的重鉻酸鉀，于28.5°C溫箱中進行孢子化。提取pEsRV451-EGFP-RFP-pEsRV234株孢子化卵囊的dsRNA，以此為模板進行RT-PCR擴增EGFP及RFP基因。同時提取孢子化后的蟲體蛋白進行Western blot分析。結果均可檢測到綠色熒光蛋白及紅色熒光蛋白的表達(見附圖2C)。說明可以利用斯氏艾美耳球蟲病毒作為一種轉染載體，攜帶外源基因在其體內表達。
【主權項】
1.一種斯氏艾美耳球蟲病毒核酸的CDNA序列，其基因序列如SEQ n0.1所示。2.斯氏艾美耳球蟲病毒RNA為載體的轉染系統，其特征在于:將含外源基因和多克隆酶切位點的基因替換斯氏艾美耳球蟲病毒dsRNA的第452位到5985位核酸序列，并用PCR反應在5’非編碼區前端引入T7啟動子，構建出可在斯氏艾美耳球蟲未孢子化卵囊體內進行外源基因表達的轉染系統。
【專利摘要】本發明公開了斯氏艾美耳球蟲病毒的核酸序列，同時還提供斯氏艾美耳球蟲體內表達外源基因的一種RNA轉染系統，所述的耳球蟲病毒基因組dsRNA全長cDNA序列6219bp。所構建的轉染系統含有多克隆酶切位點，方便外源基因在斯氏艾美耳球蟲體內的表達。該病毒轉染系統的構建，為研究斯氏艾美耳球蟲基因功能和生物學特性提供了有利的工具。
【IPC分類】C12R1/93, C12N15/86, C12N15/40
【公開號】CN104962568
【申請號】CN201510350464
【發明人】張西臣, 信彩巖, 武斌, 才學鵬, 李建華, 宮鵬濤, 楊舉, 李 赫, 張楠, 尹繼剛
【申請人】吉林大學
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年6月24日