一種蠶絲蛋白多肽及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術多肽制備領域，具體涉及蠶絲蛋白多肽制備領域。 技術背景
[0002] 蠶絲蛋白（Fibroin)又名：絲素蛋白。絲素蛋白，是從蠶絲中提取的天然高分子纖 維蛋白，含量約占蠶絲的70%~80%，含有18種氨基酸，其中甘氨酸（gly)、丙氨酸（ala) 和絲氨酸（ser)約占總組成的80%以上。
[0003] 蠶絲蛋白質在化妝品領域被開發利用。由于蠶絲蛋白質與人體皮膚角朊蛋白質極 相似，兩者有極好的親和性；由于蠶絲蛋白質分子特殊的化學結構，所以蠶絲蛋白質具有良 好的吸濕性和散濕性能，能適應周圍環境的變化，起天然調濕、改善人體皮膚營養、防止皮 膚起皺、增強皮膚細胞活力和彈性、促進細胞新陳代謝及維持皮膚正常生理狀態的作用；蠶 絲蛋白質還具有吸收紫外線，防止日光輻射對人體皮膚損害的作用，所以蠶絲蛋白質已被 廣泛用于美容化妝品的優良添加劑。
[0004] 然而，蠶絲蛋白是具有66個氨基酸的蛋白質，分子量較大，往往會引起過敏反應， 導致皮膚瘙癢，從而無法起到應有的護膚作用。小分子蛋白質或多肽就不容易誘發免疫變 態反應。但是，小分子蛋白質往往會失去原形蛋白質的功效。因此，如何才能讓分解后的蠶 絲蛋白小分子既有原蛋白質的功效，且不引起過敏，一直是一個難以協調的問題。
【發明內容】
[0005] 發明目的
[0006] 針對現有蠶絲蛋白化妝品的現狀，發明一種蠶絲蛋白多肽及制備和應用，制備的 蠶絲蛋白多肽，該多肽應用于化妝品，其既有原蠶絲蛋白的功效，而且不產生過敏反應。
[0007] 技術方案
[0008] 本發明為一種蠶絲蛋白多肽，其序列為DDTDKSIAILNVQEILKDM。制備步驟包括 ⑴將清洗、烘干后的蠶繭500g剪碎，加入500-1000ml去離子水中；（2)煮沸、超聲1-2小 時，同時緩慢攪拌；（3)待溶液冷卻后，加入水解酶，在20-40°C反應30-60分鐘；（4)離心 2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（5)將上清液加入ρΗ6· 0-6. 5的偏酸性緩沖液中，攪拌， 離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；(6)將沉淀物復溶于ρΗ5. 0-5. 5緩沖液中， 采用葡聚糖凝膠層析技術，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。所述的水解酶，可以是木 瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶、合歡蛋白酶、朝鮮薊蛋白酶等。所述的 蠶絲蛋白多肽，在制備化妝品中的應用。
[0009] 本發明多肽也可委托上海吉爾合成，純度為95%以上。
[0010] 有益效果
[0011] 本發明的制備得到的蠶絲蛋白多肽，經蛋白質序列測定，序列為 DDTDKSIAILNVQEILKDM，純度大于70 %。實驗表明，該多肽能抗氧化的作用，作用與原蠶絲蛋 白相當。抗原實驗結果表明，該多肽沒有抗原性，體外抑制酪氨酸酶的實驗證實其具有美白 功能。
[0012]
【具體實施方式】
[0013] 實施例1
[0014] 將清洗、烘干后的蠶繭500g剪碎，加入500-1000ml去離子水中；煮沸、超聲 1-2小時，同時緩慢攪拌；待溶液冷卻后，加入菠蘿蛋白酶，在室溫反應60分鐘；離心 2000rpm，5-10分鐘，取上清；將上清液加入pH6. 0-6. 5的偏酸性緩沖液中，攪拌，離心 10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；將沉淀物復溶于pH5. 0-5. 5緩沖液中，采用葡聚 糖凝膠層析技術，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白質自動測序儀測定 該多肽的序列為DDTDKSIAILNVQEILKDM，純度為87. 8%。
[0015] 實施例2
[0016] 將清洗、烘干后的蠶繭500g剪碎，加入500-1000ml去離子水中；煮沸、超聲 1-2小時，同時緩慢攪拌；待溶液冷卻后，加入無花果蛋白酶，在37°C反應30分鐘；離 心3000rpm，5-10分鐘，取上清；將上清液加入pH6. 0-6. 5的偏酸性緩沖液中，攪拌，離心 10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；將沉淀物復溶于pH5. 0-5. 5緩沖液中，采用葡聚 糖凝膠層析技術，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。采用固相蛋白質自動測序儀測定 該多肽的序列為DDTDKSIAILNVQEILKDM，純度為76. 5%。
[0017] 實施例3
[0018] 將上海吉爾合成的多肽添加入乳膏基質中，進行免疫原性檢測。BALB/c白鼠6只， 雌雄各半，將小鼠背部脫毛，裸露皮膚。分別取不同濃度的蠶絲蛋白多肽溶液（0.5，1.0， 2. Omg/ml)以1. 25 μ L/cm2涂敷密度短期1次涂敷，每日涂敷1次，連續8周，于1-12周 眼眶靜脈叢定點取血每周一次，12000rpm離心2min，分離血衆取上清液，-20°C低溫保存備 用。待室溫溶解后，取0.1ml上清液間接ELISA檢測血清中抗體滴度。以各樣品實際A值 (0D450)比陰性對照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即為陽性，將Blood bio-samples樣品 作一系列稀釋后進行檢測，呈陽性反應的最高稀釋度即為該樣品的滴度。測定結果顯示。 1-12周收集的血樣，經ELISA間接法檢測多肽誘導抗體均為陰性。由此可見，本發明得到的 蠶絲蛋白多肽無免疫原性。
[0019] 實施例4
[0020] 將上海吉爾合成的多肽添加入乳膏基質中，采用1，1-二苯基-2-苦肼基 (l，l-diphenyl-2_picryhydrazyl，DPPH)法測定蠶絲蛋白多肽清除自由基活性。分別取 不同濃度的蠶絲蛋白2. Omg/ml、蠶絲蛋白多肽溶液（0· 5, L 0, 2. Omg/ml) I. 0ml，置IOml離 心管中，加入3. Oml的DPPH溶液，室溫避光反應30min，同時以無水乙醇為空白，于517nm 波長處測定吸光值。按下列公式計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率（％)= A0-(As-Ac)/A0X 100% (公式中，A〇-l. Oml 蒸餾水 +3. OmlDPPH 溶液的吸光度值;As-1.0ml 樣品溶液+3. OmlDPPH溶液的吸光度值；A。一1.0 ml樣品溶液+3. Oml無水乙醇的吸光度值）， 將實驗重復三次，2. 0mg/ml蠶絲蛋白、0. 5,1. 0,2. 0, mg/ml蠶絲蛋白多肽溶液的清除率分 別為34. 89、24. 43、32. 65、54. 98%。可見，蠶絲蛋白多肽溶液具有抗氧化的作用，且與原型 蠶絲蛋白相比，其抗氧化作用不變。
[0021] 實施例5
[0022] 抑制酪氨酸酶的實驗
[0023] 上海吉爾合成的多肽給藥組反應混合物2mL :0.1 M pH6. 8PBS 0. 9mL加不同濃度 的多肽111^加0.03%酪氨酸0.1111匕37°〇的恒溫箱孵育101^11，力卩0.11^的酪氨酸酶（35011/ mL)水溶液，將溶液混合均勻，置于37°C的恒溫箱中反應25min后，用分光光度計于475mm 測定吸光度值；陰性對照組以等體積的蒸餾水代替多肽用分光光度計于475mm測定吸光度 值；陽性對照組用熊果苷代替多肽用分光光度計于475mm測定吸光度值；0.1 M pH 6. 8PBS 按照2005版《中國藥典》配制。多肽分為l、5、10mg/mL。同時，以熊果苷（10mg/mL)作為陽 性對照組。抑制率％= (1-給藥組/陰性組）*1〇〇%;每個濃度多肽實驗均重復統計學處 理試驗數據以均數土標準差（X土s)表示，采用t檢驗，使用Excel軟件做數據分析處理。
[0024]
[0025] 皮膚黑素形成是一個十分復雜的過程，在皮膚黑素的形成過程中由于受到紫外 線、遺傳、內分泌、炎癥介質、飲食不當等因素的影響，色素代謝異常，皮膚黑素過快增長和 分布不均，就會造成局部皮膚過黑及色素沉著，表現為黃褐斑、雀斑和炎癥后色素沉著等。 酪氨酸酶為含Cu離子的氧化酶，其普遍存在于哺乳動物、植物和微生物中，主要參與生物 體內黑色素和其他多酚類物質的形成過程，是生物體合成黑色素的關鍵酶，酪氨酸酶抑制 劑就是通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，因而可用來預防和治療色素沉著等。 本發明通過體外實驗觀察了多肽對酪氨酸酶活性的抑制作用，結果表明不同濃度的多肽液 對酪氨酸酶活性均有抑制作用，且具有顯著的量效關系，證實其具有確切的美白祛斑功效。
【主權項】
1. 一種蠶絲蛋白多肽，其特征在于，序列為DDIDKSIAILNVQEILKDM。2. 根據權利要求1所述蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟包括（1)將清 洗、烘干后的蠶繭500g剪碎，加入500-1000ml去離子水中；（2)煮沸、超聲1-2小時， 同時緩慢攪拌；（3)待溶液冷卻后，加入水解酶，在20-40 °C反應30-60分鐘；（4)離心 2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（5)將上清液加入pH6. 0-6. 5的偏酸性緩沖液中，攪拌， 離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；（6)將沉淀物復溶于pH5. 0-5. 5緩沖液中， 采用瓊脂糖凝膠層析技術，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。3. 根據權利要求書2所述蠶絲蛋白多肽的制備方法，其特征在于，所述的水解酶是木 瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶、合歡蛋白酶或朝鮮薊蛋白酶。4. 根據權利要求書1所述的蠶絲蛋白多肽在制備化妝品中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種蠶絲蛋白多肽，涉及生物技術多肽制備領域。其序列為DDTDKSIAILNVQEILKDM。其制備步驟包括（1）將清洗、烘干后的蠶繭500g剪碎，加入500-1000ml 去離子水中；（2）煮沸、超聲1-2小時，同時緩慢攪拌；（3）待溶液冷卻后，加入水解酶，在20-40℃反應30-60分鐘；（4）離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（5）將上清液加入pH6.0-6.5的偏酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；（6）將沉淀物復溶于pH5.0-5.5緩沖液中，采用瓊脂糖凝膠層析技術，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。本發明可作為制備化妝品中的添加劑。本發明制備的蠶絲蛋白多肽，純度大于70%。實驗表明，該多肽能抗氧化的作用，作用與原蠶絲蛋白相當。抗原實驗結果表明，該多肽沒有抗原性。
【IPC分類】C07K7/08, A61Q19/08, A61Q19/02, A61K8/64, A61Q19/00, C12P21/06
【公開號】CN104961805
【申請號】CN201510451393
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月28日