一種治療癌癥的活性肽及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是生物技術領域，具體涉及從芋螺中分離得到的治療舌癌的活性 肽。
【背景技術】
[0002] 癌癥是對人類生命健康危害最大的疾病之一，每年都有大量的人死于癌癥。抗癌 藥物的研發一直是藥學研宄的熱點。抗腫瘤藥物中有74%是天然產物或其衍生物，如紫杉 醇及其衍生物就是目前臨床上應用效果比較好的抗腫瘤藥物。因此，從天然產物中尋找抗 癌化合物或先導化合物具有重要的意義。
[0003] 舌癌早期可表現為潰瘍、外生與浸潤3種類型。有的病例的第一癥狀僅為舌痛，有 時可反射至顳部或耳部。外生型可來自乳頭狀瘤惡變。浸潤型表面可無突起或潰瘍。潰 瘍型及浸潤型癌常伴有自發性疼痛和程度不同的舌運動受限；外生型一般舌運動障礙不明 顯，較少自發痛。舌癌進入晚期可直接超越中線或侵犯口底，亦可浸潤下頒骨舌側骨膜、骨 板或骨質。向后則可延及舌根或咽前柱和咽側壁。此時舌運動可嚴重受限、固定、涎液增多 外溢。進食、吞咽、言語均感困難。疼痛劇烈，可反射至半側頭部。關于舌癌早期診斷的醫 療器械目前還未見報道。
[0004] 芋螺，亦稱雞心螺，系軟體動物門，腹足綱，前鰓亞綱，芋螺科（Conidae)動物之總 稱。殼呈圓錐形或紡錘形，表面常有各色花紋。殼口窄長，厴小而不能遮蓋殼口。全球有約 500種，我國有百余種。它們分布于熱帶海域中的淺水區，少數在廣東、廣西沿海，海南島北 部，個別種延伸到東海。芋螺雖然種類很多，個體大小和食物類型有很大差異，但它們都是 食肉動物，而且是靠它們的毒液來捕食獵物。按照食性，芋螺大致可分為三類，食魚芋螺、食 其它軟體動物的食螺芋螺和以蠕蟲為食的食蟲芋螺。其中食魚芋螺毒液的毒性最高，食蟲 芋螺的毒性最低。
[0005] 至今已有數種芋螺毒素申請美國專利，它們在鎮痛、局部缺血性保護、癲癇治療、 某些疾病診斷和受體研宄中具有廣泛的應用價值，有的已進入臨床研宄或已被FDA正式批 準為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮痛藥。如由Olivera等從幻芋螺（Conus magus)中 分離的ω-CTX，MVIIA，已被美國FAD正式批準為治療頑痛的藥物，其商品名Ziconotide。
[0006] 申請人通過研宄發現，芋螺體內的一系列的小肽具有較好的抑制癌癥的效果。
【發明內容】
[0007] -方面本發明涉及一類治療舌癌的多肽。其結構具有以下形式： CM-03 ：AQNDCGSSYQFSV CM -05 ： GNNRSARRVDDSP CM -06 ： DCCCPPMKLLIIGSSSRSR CM -09 ： AAAYYSSVRRVffffTSPGEQ CM -11 ： QPPEEGNDRCGSGRVPAM CM -12 ： NRGSTWYILLPPGSSRPS CM -14 ： VVGSSEEQGHIPARDCCRV CM -16 ： IKDCMMPGSRAARRGSRLL CM -19 : QPTWGECDDQQHILARVPSS CM -20 ： KKPARDDNRAGSKKSSVP CM -21 ： DDARMMKLHGSSQQEPSRV CM -23 ： APDDGSSRVPTKQEPR CM -27 ： GRVILPDKRVPPSSAKff CM -29 ： IGRMDKQQNRGSSff CM -31 ： VRPGSRDKILLPPGAR CM -34 ： GSNNPQTTSRVCPRSGGG 另一方面，本發明提供一種分離所述多肽的方法，（I)將芋螺先用PBS緩沖液清洗，然 后用13mmol/L HCl溶液勻漿在10攝氏度條件下制備成粗制液；（2)將步驟（1)所得粗制液 用8000轉/分鐘離心20分鐘，收集上清液，將上清液用三層紗布過濾，而后加入木瓜蛋白 酶(酶活力為800AU/g) lkg，繼續保溫并不斷攪拌進行酶解反應3h，得到酶解液。用葡聚糖 G-50 (Sephadex G-50) (I. 5cmX 90cm)分離，19mmol/L HCl 溶液洗脫，流速 I. 3mL/ 分鐘，收 集洗脫產物，調節溶液至PH6. 8,10000轉/分鐘離心15分鐘，上清液冷凍干燥備用；經十二 烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，回收小分子量的條帶，經過驗證，獲得了 40 個小的多肽，經過試驗證實了其中有16個具有較好的生物學活性。
[0008] 另一方面，本發明提供一種藥物組合物，所述的組合物含有如上所述的體多肽。
[0009] 如上所述的藥物組合物，其還含有還包含一種或多種藥學上可接受的載體；優 選地，所述藥學上可接受的載體選自：水溶性填充劑、PH調節劑、穩定劑、注射用水和滲透 壓調節劑； 更優選地，所述水溶性填充劑選自以下的一種或幾種：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨 醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖； 更優選地，所述PH調節劑為生理可接受的酸、堿和/或鹽，優選選自以下的一種或幾 種： 非揮發性酸如枸櫞酸、磷酸、乳酸、酒石酸或鹽酸，堿如氫氧化鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀 或氫氧化銨，鹽如碳酸鈉或碳酸鉀或碳酸銨鹽，碳酸氫鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫銨鹽； 更優選地，所述穩定劑為選自以下的一種或幾種：EDTA-2Na、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸 鈉、亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇 4000、十二烷基硫酸鈉或三羥甲基氨基甲烷等，進一步優選自：焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、 精氨酸、聚乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷中的一種或幾種； 更優選地，所述滲透壓調節劑選自氯化鈉和/或氯化鉀。
[0010] 本發明再一方面還提供上述多肽在制備治療腫瘤的藥物中的應用。
[0011] 并且，所述藥物組合物優選為注射劑，更優選地為凍干粉針或溶液注射劑。
[0012] 本發明的又一方面還提供一種藥物組合物，包含上述所述的多肽。
[0013] 優選地，還包含可接受的輔料成分。
[0014] 本發明的優點在于： 提供了一種多肽能夠抗腫瘤，同時具有較好的穩定性。
【具體實施方式】
[0015] 實施例1多肽的分離獲得 (1)將芋螺先用PBS緩沖液清洗，然后用13mmol/L HCl溶液勻漿在10攝氏度條件下制 備成粗制液；（2)將步驟（1)所得粗制液用8000轉/分鐘離心20分鐘，收集上清液，將上清 液用三層紗布過濾，而后加入木瓜蛋白酶(酶活力為800AU/g) lkg，繼續保溫并不斷攪拌進 行酶解反應3h，得到酶解液。用葡聚糖G-50(Sephadex G-50) (I. 5cmX90cm)分離，19mmol/ L HCl溶液洗脫，流速I. 3mL/分鐘，收集洗脫產物，調節溶液至pH6. 8,10000轉/分鐘離心 15分鐘，上清液冷凍干燥備用；經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，回收 小分子量的條帶，通過測序獲得其中的40個小的多肽相應的氨基酸的序列。
[0016] 實施例2采用MTT法評價多肽對人舌癌細胞株的生長抑制作用 方法：處于生長對數期的細胞：人舌癌細胞株Tca8113和T6以2 X IO4濃度種于96 孔板中。細胞培養24 h貼壁后吸去原來的細胞培養基(為RPMI-1640培養基)。試驗分為 空白對照組、藥物處理組。空白組更換含10%胎牛血清的1640培養基；藥物處理組更換含 多肽濃度為50 μ M的細胞培養基。培養48 h后，加入濃度5 mg/mL的MTT，繼續放于CO2培養箱培養4 h，然后沿著培養液上部吸去100 μ L上清，加入100 μ L DMS0,暗處放置 10 min，利用酶標儀（Sunrise公司產品）測定吸光值（波長570nm)，并根據吸光值計算細 胞存活情況，每個處理設6個重復孔。細胞存活率（%)= Λ OD藥物處理/ Λ OD空白對照X 100。結果：有16個多肽對人舌癌細胞株Tca8113和Τ6的生長具有顯著的抑制作用，幾乎 完全不能生長。這16個多肽的序列分別如SEQ ID NO :1-16所示。
[0017] 并且，這些多肽針對二種細胞的IC5tl具體結果如下：
由上述實施例表明，本發明的多肽對人舌癌細胞株Tca8113和T6的生長具有很好的 抑制作用。由此證明，本發明的多肽具有抗舌癌活性，能用于制備抗舌癌藥物。
[0018] 實施例3多肽在小鼠體內的穩定實驗 將所述的多肽，以〇. 5mg/ml/kg的劑量注射到小鼠體內，經過一周的體內代謝，取小 鼠尾血，通過SDS-PAGE檢測，分析得到，血液中殘余的多肽大多都濃度仍然可以平均達到 0.2mg/ml/kg，這充分說明，多肽都具有較好的體內穩定性，可以用于后續的藥物用途。
[0019] 以上的結果明確說明，本發明提供了一種可用于治療癌癥的疾病。具有較好的治 療癌癥的前景D
【主權項】
1. 一種抗腫瘤多肽，其特征在于：來源于芋螺。2. 如權利要求1所述的多肽，其特征在于：其氨基酸序列為SEQ ID NO :1-16任一項所 示或者與其具有50%同源性的序列。3. 如權利要求1-2任一項所述的多肽在制備抑制腫瘤藥物中的用途。4. 一種抗腫瘤藥物制劑，它含有權利要求1-2任一項所述的多肽以及藥學上合適的載 體。5. 如權利要求3所述的用途，其特征在于：所述腫瘤為舌癌。
【專利摘要】本發明提供了一種抗舌癌的系列多肽，同時提供了一種多肽的提取方法。該系列多肽具有較強的穩定性以及抑制舌癌細胞生長的能力。這些多肽可以用于癌癥的治療。
【IPC分類】A61K38/10, A61P35/00, C07K7/08
【公開號】CN104961802
【申請號】CN201510385150
【發明人】查文娟
【申請人】查文娟
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月5日