離子交換色譜法用洗脫液以及核酸鏈的分析方法
【專利說明】
[0001] 本申請是國際申請日為2012年01月12日、申請號為201280005112. 5、發明名稱 為"離子交換色譜法用洗脫液以及核酸鏈的分析方法"的發明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及用于核酸的PCR擴增產物、該PCR擴增產物的限制性內切酶片段、或核 酸的限制性內切酶片段等目標核酸的分離檢測中的離子交換色譜法用洗脫液。另外，本發 明涉及通過使用了該洗脫液的離子交換色譜法的核酸鏈的分析方法。
【背景技術】
[0003] 離子交換色譜法是利用在柱填充劑的離子交換基團與測定對象物質中的離子之 間發揮作用的靜電相互作用來分離測定對象物質的方法。
[0004] 特別是由于對核酸、蛋白質、多糖類這樣的生物體高分子的分離優良，因此，在生 物化學和醫學等領域中被利用。
[0005] 離子交換色譜法中具有利用陰離子交換的色譜法和利用陽離子交換的色譜法。陰 離子交換使用陽離子性的柱填充劑，能夠分離陰離子性的物質。相反，陽離子交換使用陰離 子性的柱填充劑，能夠分離陽離子性的物質。
[0006] 作為陰離子交換柱填充劑的陽離子性的官能團，有二乙氨基乙基這樣的弱陽離子 性基團、季銨基這樣的強陽離子性基團，這些具有陽離子性的官能團的陰離子交換柱填充 劑已經被市售，在各種研宄領域中使用。
[0007] 核酸是由堿、糖、磷酸構成的核苷酸用磷酸酯鍵連接的生物體高分子，根據糖結構 的不同，分類成脫氧核糖核酸（DNA)和核糖核酸（RNA)。
[0008] 在使用離子交換色譜法分離核酸的PCR擴增產物、該PCR擴增產物的限制性內切 酶片段、核酸的限制性內切酶片段等目標核酸的情況下，使用利用在該目標核酸分子中包 含的磷酸的負電荷的陰離子交換液體色譜法，按鏈長能夠分離檢測該PCR擴增產物、核酸 片段等目標核酸。
[0009] 作為按鏈長分離核酸鏈的方法，廣泛使用凝膠電泳法，但作業煩雜，或測定耗費時 間等，有許多改善的余地。非專利文獻1中公開了通過高效液相色譜法分離核酸相關化合 物的方法，如果使用該方法，則不需要煩雜的作業，能夠短時間按鏈長分離檢測核酸鏈。但 是，存在難以充分地分離接近的鏈長差的問題，因此，要求進一步的分離性能的提高。
[0010] 現有技術文獻
[0011] 非專利文獻
[0012] 非專利文獻1:"歹彳7寸彳工'乂只①亡??高速液體夕口 Y卜夕歹7 4 -基礎 匕実験（用于生命科學的高效液相色譜法基礎與實驗）"、廣川書店、P. 323
【發明內容】
[0013] 發明所要解決的問題
[0014] 本發明的目的在于，提供能夠在短時間并且以高分離性能進行核酸的PCR擴增產 物、該PCR擴增產物的限制性內切酶片段、核酸的限制性內切酶片段等目標核酸的分離檢 測的離子交換色譜法用洗脫液。另外，本發明的目的在于，提供通過使用了該洗脫液的離子 交換色譜法進行的核酸鏈的分析方法。
[0015] 用于解決課題的方法
[0016] 本發明是含有由下述式（1)所示的胍衍生的胍鹽的離子交換色譜法用洗脫液。以 下詳細說明本發明。
[0017]
[0018] 本發明人發現，通過在用于離子交換色譜法的洗脫液中添加胍鹽，能夠提高核酸 鏈不同的試劑的分離性能，從而完成了本發明。
[0019] 本發明的離子交換色譜法用洗脫液含有由上述式（1)所示的胍衍生的胍鹽。
[0020] 作為上述胍鹽，可以列舉例如：胍鹽酸鹽、胍硫酸鹽、胍硝酸鹽、胍碳酸鹽、胍磷酸 酯、胍硫氰酸鹽、胍氨基磺酸鹽、氨基胍鹽酸鹽、氨基胍碳酸氫鹽等。其中，優選使用胍鹽酸 鹽、胍硫酸鹽。
[0021] 本發明的離子交換色譜法用洗脫液中的胍鹽的分析時的濃度，根據分析對象物適 當調節即可，但優選為2000mmol/L以下。
[0022] 具體而言，可以列舉：使胍鹽的濃度在0~2000mmol/L的范圍內進行梯度溶出的 方法。因此，分析開始時的胍鹽的濃度無需為0mm 〇l/L，另外，分析結束時的胍鹽的鹽濃度也 無需為 2000mmol/L。
[0023] 上述梯度溶出的方法可以為低壓梯度法也可以為高壓梯度法，但優選在進行利用 高壓梯度法的精密的濃度調節的同時使其溶出的方法。
[0024] 上述胍鹽可以單獨添加到洗脫液中，也可以與其他鹽組合添加。作為能夠與上述 胍鹽組合使用的鹽，可以列舉例如：由氯化鈉、氯化鉀、溴化鈉、溴化鉀等鹵化物和堿金屬構 成的鹽、由氯化鈣、溴化鈣、氯化鎂、溴化鎂等鹵化物和堿土金屬構成的鹽、高氯酸鈉、高氯 酸鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀等無機酸鹽等。另外，也可以使用乙酸鈉、乙 酸鉀、琥珀酸鈉、琥珀酸鉀等有機酸鹽。
[0025] 作為用于本發明的離子交換色譜法用洗脫液的緩沖液，可以使用公知的緩沖液類 和有機溶媒類，具體而言，可以列舉例如：Tris鹽酸緩沖液、由Tris和EDTA構成的TE緩沖 液、由Tris和乙酸和EDTA構成的TAE緩沖液、由Tris和硼酸和EDTA構成的TBA緩沖液等。
[0026] 上述洗脫液的pH沒有特別限定，只要是通過陰離子交換能夠分離核酸鏈的范圍 即可。
[0027] 使用本發明的離子交換色譜法用洗脫液的核酸鏈的分析方法也是本發明之一。
[0028] 用于本發明的核酸鏈的分析方法的色譜柱，只要是填充有陽離子性填充劑的陰離 子交換柱即可，可以使用：市售品、使用在基材微粒的表面上具有強陽離子性基團團和弱陰 離子性基團的填充劑的陰離子交換柱等。
[0029] 作為能夠采用本發明的核酸鏈的分析方法的目標核酸（檢測對象），可以列舉：核 酸的PCR擴增產物、該PCR擴增產物的限制性內切酶片段、或核酸的限制性內切酶片段，可 以例示：來自病毒或基因多態的疑似來自人的核酸、即用于判別病毒的存在和形態的來自 病毒的核酸（DNA、RNA)、用于判別基因多態（單核苷酸多態性）的來自人的DNA。
[0030] 上述DNA或上述RNA通過公知的方法進行提取、精制后，根據需要，通過PCR(聚合 酶鏈反應，Polymerase Chain Reaction)法等擴增，將該擴增產物用于使用本發明的離子 交換色譜法用洗脫液的離子交換色譜法。
[0031] 病毒為RNA病毒等的情況下，相對于提取、精制后的RNA，進行RT-PCR(逆轉錄聚合 酶鏈反應，Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)反應，可以得到 PCR 擴 增產物。
[0032] 另外，使用本發明的核酸鏈的分析方法來判別基因多態的情況下，作為 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism:限制性內切酶片段長多態）法， 可以應用公知的技術。RFLP法為如下方法：在存在識別PCR擴增產物中的基因變異部的限 制性內切酶的情況下，在共有序列部位設定引物，在其內側、即PCR擴增產物內具有多態性 進行擴增，用上述限制性內切酶切斷所得到的PCR擴增產物，根據該片段的長度判定多態 的有無。在發生基于限制性內切酶的切斷的情況下和沒有發生的情況下，產生的片段的數 和尺寸均不同，因此，基于此，可知是否引起切斷、進而目標位置的堿基為何種。
[0033] 對于基于引物的擴增區域在引起利用限制性內切酶的切斷的情況下所產生的2 個片段而言，以分別通過使用本發明的離子交換色譜法用洗脫液的離子交換色譜法能夠明 確檢測的尺寸、優選小的片段達到Ibp以上、更優選達到20bp以上的方式進行設定。另外， 產生的2個片段的尺寸之差，以通過本發明的核酸鏈的分析方法能夠明確檢測、優選達到 Ibp以上，更優選達到20bp以上的方式進行設定。擴增區域的尺寸的上限沒有特別限制， 但太大時，浪費PCR的時間和成本，另外，也不具有由此產生的優點，因此，優選為1000 bp以 下。引物的堿基長度只要是發揮各自的功能的長度即可，作為引物的堿基長度的例子，為 15~30bp、優選為20~25bp。
[0034] 利用上述PCR法的擴增可以通過1個階段進行，但為了進一步提高敏感度，也可以 在第1階段的PCR中擴增更寬范圍的區域，將所得到的PCR擴增產物作為模板，將其中包含 的區域通過第2階段的PCR進一步擴增（nested PCR)。此時，用于第2階段的PCR的引物 二者可以均與用于第一階段的PCR的引物不同，也可以使用僅一種不同的引物，另一種與 第1階段的PCR中使用的引物相同（hemi-nested PCR)。
[0035] 上述PCR法自身是公知的，用于通過PCR法的分離檢測的試劑盒也已經被市售，因 此，能夠容易地實施。用于PCR法的引物的設計、DNA的擴增的條件，可以參照Molecular Cloning ：A Laboratory Ma