一種重組木聚糖酶的制備及其應用于木薯渣降解的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種重組木聚糖酶的制備，以及利用該重組木聚糖酶降解木薯渣的方法。
【背景技術】
[0002]木聚糖酶是指能夠專一降解木聚糖為低聚木糖和木糖的一類酶的總稱，由于木聚糖是植物半纖維的主要成分，在自然界中廣泛存在，無論是作為工業生產原料或加工副產物中的木聚糖，其有效降解都具有十分重要的意義。因此從六十年代起，人們就已經關注木聚糖酶的研宄，涉及領域包括食品、飼料、造紙、能源工業等方面。
[0003]目前，木聚糖酶產生菌包括真菌、細菌及基因工程菌，不同來源的木聚糖酶其酶學性質和底物的專一性有所不同，因此針對不同需要，選擇相應的木聚糖酶才能充分發揮酶解作用。
[0004]木薯是世界三大薯類作物之一，作為工業原料，其加工后產生大量的殘渣。木薯渣的累積不僅造成資源的浪費，而且會對環境造成污染。木薯渣中含有大量的木質纖維素資源，如能將其有效利用，則可變費為利，但目前對木薯渣中半纖維素的降解尚無高效的方法。Clostridium clariflavum DSM19732能夠以木薯澄為底物，在55°C下生長良好，推測該菌應具有相應的半纖維素降解酶系，而針對其所產木聚糖酶尚無文獻報道。
[0005]因此，開發Clostridium clariflavum DSM19732木聚糖酶，并將其用于木薯澄中木質纖維素的降解，具有一定的經濟和社會效益。
【發明內容】
[0006]本發明的一個目的在于獲得重組Clostridium clariflavum DSM19732木聚糖酶的制備方法，開發新型木聚糖酶。
[0007]本發明的另一個目的是應用上述重組木聚糖酶處理木薯渣，提高木薯渣中木質纖維素的降解效率，解決木薯渣中木質纖維素資源利用率低的問題。
[0008]為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案:
[0009]I)目的木聚糖酶基因的獲得:用細菌基因組DNA提取試劑盒提取含有Clostridium clariflavum DSM19732 的基因組，得到基因組 DNA 溶液；
[0010]2)重組表達載體的構建:根據數據庫中報道的Clostridium clariflavumDSM19732木聚糖酶基因序列設計帶有限制性內切酶BamH I和Not I的引物，以步驟I)所得基因組DNA溶液為模板，進行PCR擴增，并對擴增產物進行純化，然后用限制性內切酶BamHI和Not I雙酶切已純化的PCR產物和質粒pET-28a，用T4連接酶16°C過夜連接，得到重組表達載體；
[0011]3)重組木聚糖酶的誘導表達:將步驟2)中所得到的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，培養細胞，誘導重組木聚糖酶的表達；
[0012]4)誘導重組木聚糖酶的表達條件:菌體生長0D_值為0.6-1.6 ;誘導劑IPTG濃度為0.05-lmmol/L ;誘導溫度為16_37°C ;誘導時間為4_8h ；
[0013]5)重組木聚糖酶液制備:收獲步驟4)的菌體，8000-10000rpm離心15_20min，沉淀用20mmol/L、pH 6.0-7.5Tris_HCl緩沖液重懸，混勻后超聲破碎10_15min，之后8000_10000rpm離心15_20min，取上清液即為木聚糖酶液；
[0014]6)重組木聚糖酶應用于木薯渣降解:在20目的木薯渣中加入質量體積比濃度為 I % -3 % 的 20mmol/L、pH 6.0-7.5Tris_HCl 緩沖液，加入 100-400U 步驟 5)的酶液及100-5000U纖維素酶，55-60°C恒溫48_96h，測量木薯渣中纖維素、半纖維素含量以及木薯渣的失重率。
[0015]以上技術方案中所有基本分子生物學操作均參照“分子克隆實驗指南”(第三版，科學出版社，2002年)。
[0016]I個酶活單位(U)定義為在給定條件下，每分鐘降解1%的木聚糖溶液生成I ymol還原糖需要的酶量。
[0017]所得重組木聚糖酶具有以下特性:
[0018]I)最適反應溫度
[0019]在40_80°C表現出催化活力，最適反應溫度為60°C ;
[0020]2)最適反應pH
[0021]在pH4_8范圍內表現出催化活力，最適pH為6.0 ;
[0022]3)熱穩定性
[0023]在40-60°C表現出很好的熱穩定性，60°C保溫30min，活力仍保持在90%以上；
[0024]4) pH 穩定性
[0025]在pH 5-8具有良好的穩定性，pH8, 4°C保持60min，仍保持90%的酶活力。
[0026]木薯渣的處理效果:與僅添加纖維素酶相比，同時添加重組木聚糖酶與纖維素酶，木薯渣失重率提高5% -10% ;木薯渣中纖維素含量降低2-5% ;半纖維素含量降低2-7%。
[0027]本發明采用的重組木聚糖酶的制備方法，較從Clostridium clariflavumDSM19732中直接獲取木聚糖酶，重組大腸桿菌細胞易于培養，產酶周期短。
[0028]與僅添加纖維素酶處理木薯渣的工藝相比，添加本發明制備的木聚糖酶，可降低木薯渣中纖維素和半纖維素含量。
[0029]實施例1
[0030]重組木聚糖酶的制備，具體如下:
[0031]I)目的木聚糖酶基因的獲得:用細菌基因組DNA提取試劑盒提取含有Clostridium clariflavum DSM19732 的基因組，得到基因組 DNA 溶液；
[0032]2)重組表達載體的構建:根據數據庫中報道的Clostridium clariflavumDSM19732木聚糖酶基因序列設計帶有限制性內切酶BamH I和Not I的引物以步驟I)所得基因組DNA溶液為模板，進行PCR擴增，并對擴增產物進行純化，然后用限制性內切酶BamHI和Not I雙酶切已純化的PCR產物和質粒pET-28a，用T4連接酶16°C過夜連接，得到重組表達載體；
[0033]3)重組木聚糖酶的獲得:將步驟2)中所得到的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中進行培養，當OD6c?為1.25時，添加終濃度為0.lmmol/L的誘導劑IPTG，23°C誘導6h，8000rpm離心15min，收集菌體，并用20mmol/L、pH 7.0Tris-HCl緩沖液重懸，混勾后超聲破碎lOmin，之后8000rpm離心15min，取上清液，即得到15.2U/mg蛋白的木聚糖酶液。
[0034]實施例2
[0035]利用本發明得到的重組木聚糖酶處理木薯渣，具體如下:
[0036]在20目的木薯渣中加入質量體積比濃度為1%的20mmol/L、pH 7.0Tris-HCl緩沖液，加入270U的重組木聚糖酶液及4000U纖維素酶，55°C恒溫96h，較僅添加纖維素酶處理效果相比，木薯渣的失重率增加了 9%，纖維素含量下降了 2.5%，半纖維素含量下降了
【主權項】
1.一種重組木聚糖酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一、用細菌基因組DNA提取試劑盒提取含有Clostridium clariflavum DSM19732的基因組，得到基因組DNA溶液； 步驟二、根據數據庫中報道的Clostridium clariflavum DSM19732木聚糖酶基因序列設計引物，以步驟一所得基因組DNA溶液為模板，進行PCR擴增，得到木聚糖酶基因，并與質粒pET-28a連接，得到重組表達載體； 步驟三、將步驟二中所得到的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，培養細胞，誘導重組木聚糖酶的表達； 步驟四、收集步驟三中的菌體細胞，用pH 6.0-7.5的Tris-HCl緩沖液重新懸浮，超聲破碎細胞并離心，取上清即為木聚糖酶液。2.—種如權利要求1所述的重組木聚糖酶應用于木薯渣降解的方法，其特征在于，在20目的木薯渣中加入質量體積比濃度為1% -3% pH6.0-7.5的Tris-HCl緩沖液，加入100-400U重組木聚糖酶及100-5000U纖維素酶，55-60°C恒溫48_96h。
【專利摘要】本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種重組木聚糖酶的制備以及應用該重組木聚糖酶降解木薯渣的方法。本發明將Clostridium clariflavum DSM19732的木聚糖酶基因與質粒pET-28a連接，轉化大腸桿菌BL21，誘導表達，細胞破碎得到重組木聚糖酶，將該酶處理木薯渣，降低了木薯渣中纖維素和半纖維素的含量。用該方法制備的重組木聚糖酶，具有良好的酶學性質，處理木薯渣后可提高木薯渣中木質纖維素的降解效率。
【IPC分類】C12N9/42, C12P19/14, C12N15/70, C12N15/56, C12R1/145
【公開號】CN104946614
【申請號】CN201510340887
【發明人】唐蕾, 胡方覬, 王榮, 余嘉慧, 張建華, 張宏建, 毛忠貴
【申請人】江南大學
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年6月18日