一種癌癥早期基因診斷試劑盒及診斷方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及癌癥基因診斷和基因治療領域，尤其涉及一種癌癥早期基因診斷試劑 盒及診斷方法。
【背景技術】
[0002] 現有技術中已經研宄出關于癌癥發病的原理和病因，癌癥發病有以下步驟：1，致 病基因突變/擴增；2,其調芐基因缺失/失活；3,癌變基因擴增：骨髓等組織干細胞從只有 致病基因突變/擴增的癌前干細胞，發展為擁有致病基因和癌變基因雙擴增的癌干細胞； 4,癌干細胞表面多個生長因子受體與其微環境中多種生長因子間的互動，推動癌干細胞集 落向癌瘤發展；5,在轉化生長因子及其受體等因素介導下發生癌瘤細胞侵潤和轉移，并形 成新部位的癌瘤。
[0003] 目前，國內外流行的基因診斷多采用聚合酶鏈反應（PCR)技術。采用已知基因的 一對引物（primers)，以待測生物標本DNA作模板，在特定的反應系統中，經過熱變性-退 火-延伸，數十個循環后，對反應產物作聚丙烯酰胺電泳分析，觀察電泳帶型及其強度，判 斷待測基因擴增與否，及其與疾病的關系。近10幾年來，在此基礎上作技術改進，發明適時 定量PCR儀，克服了普通PCR儀的缺點，并使產物定量化，從而更適合臨床使用。
[0004] 為了徹底戰勝癌癥，本發明創作者經過長期努力，在創立癌癥早期基因治療技術 并應用于臨床的同時，開發出癌癥早期基因診斷技術和晚期癌特定組合的靶向治療加基因 治療技術。這些都是前所未有的發明和創造。而非對某項技術的補充。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種癌癥早期基因診斷試劑盒及診斷方法，滿足癌癥早期 基因治療的需要。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供一種癌癥早期基因診斷試劑盒，試劑盒包含致病基 因和癌變基因兩對PCR引物；
[0007] 其中，V-erbB PCR引物序列如下：
[0008] Pl:5 'CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3' ；
[0009] P2 :5 VTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3,；
[0010] TS引物序列根據TS基因編碼區隨機設計。
[0011] 本發明還提供一種癌癥早期基因診斷試劑盒的診斷方法，采用聚合酶鏈反應方 法，即針對上述兩基因設計兩對引物，會同其它試劑組合而成基因診斷試劑盒；
[0012] 步驟a，骨髓細胞模板DNA的提取：用小刀將患者骨髓涂片上的細胞刮下來，收集 于 1.5ml EP 管內，加入 TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mM Nacl，PH8.0)液 500ul，10% SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55°C水浴中孵育5小時；
[0013] 步驟b，聚合酶鏈反應條件：模板變性條件為97 °C，7分鐘，32個循環，每個循環中 變性條件為94°C 5分鐘，退火條件為52°C，1分鐘，延伸條件為72°C，2分鐘，最后一次循環 之后延伸時間為5分鐘，取出置于4°C保存。
[0014] 現將本基因診斷法產生之前的研發過程簡述如下：
[0015] 1，吸收國外有關研宄成果即禽類原始紅細胞增多癥（Avian Erythroblastosis) 及其傳染性致病病毒（AEV-ES4)基因組所含癌基因 V-erbB和V-erbA。正是它們的協同作 用導致禽類紅白血病的發生。研宄證明，V-erbB產物與EGFR-TK，高度同源且EGFR在大多 數腫瘤高表達。針對EGFR的單抗和針對TK的小分子抑制劑治療腫瘤均有效。
[0016] 2,引進上述病毒癌基因作探針和Southern blot雜交技術，對急性白血病，腫瘤， MDS，特別是家族性白血病和MDS，進行細胞遺傳學和一系列分子生物學研宄。并最終證明， 內源性V-erbB是白血病等癌癥共同致病基因。它的缺失或插入等突變并擴增，導致白血病 等癌癥的發生。
[0017] 3,骨髓細胞姐妹染色單體分染和互換（S⑶/SCE)技術證明：1) S⑶陰性（細胞周 期成倍延長）之MDS，轉白血病的機制在于骨髓造血細胞TS基因協同擴增；2)骨髓細胞SCE 水平（SCE/Cell)愈高，其原始程度愈高。換言之，干細胞有最高水平SCE，說明它最易于發 生突變。鑒于國外認為癌癥是干細胞基因突變所致，我們因而認為，上述內源性V-erbB突 變最大可能發生于骨髓和組織干細胞。
[0018] 4,骨髓發生代賞性增生的機制在于骨髓干細胞發生EGFR，TS/TK等基因擴增。此 間，已有V-erbB突變/擴增的白前干細胞勢必發生上述代賞性增生和相應的基因擴增，從 而形成擁有雙重癌基因擴增的癌干細胞。美國NIH證明，TS基因是個癌基因，我們則認定 此基因為癌變基因。因為它強化了癌前干細胞的增殖力，使骨髓原始和早幼粒細胞％增加， 同時染色體和細胞周期異常檢出率也增加。MDS患者轉白血病率也增加。因此，白血病等癌 癥發生的重大危險在于癌干細胞生成及其癌克隆形成和隨后的發展。
[0019] 與現有技術相比較，本發明的有益效果在于：本專利的目的在于對癌癥作早期基 因診斷，即同時檢測骨髓標本是否有致病基因和癌變基因的擴增，以便進行基因治療和預 防，實現癌癥的治愈。而晚期癌治療很困難，費用很高，死亡率也高。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發明的適應癥MDS疾病發展演進圖；
[0021] 圖2為本發明的PCR產物電泳圖A ;
[0022] 圖3為本發明的PCR產物電泳圖B ;
[0023] 圖4為本發明的圖B的光掃描圖。
【具體實施方式】
[0024] 以下，對本發明上述的和另外的技術特征和優點作更詳細的說明。
[0025] 本發明的試劑盒旨在早期發現和診斷白血病等癌癥，以便早期基因治療和預防。 從而避免發展到晚期，轉移和死亡。因此，本發明中的試劑盒將主要針對不同癌癥共同致病 基因和癌變基因的擴增，采用PCR基因擴增技術進行檢測。
[0026] 本發明的試劑盒的成分為：試劑盒包含致病基因和癌變基因兩對PCR引物；
[0027] 其中，V-erbB PCR引物序列如下：
[0028] Pl:5 'CAC TGT GTG AAG GCC TGC 3' ；
[0029] P2 :5 VTT ATA AAT AGT GCC AAA AGC 3' ；
[0030] TS引物序列根據TS基因編碼區隨機設計。
[0031] 本發明的試劑盒的使用方法：采用聚合酶鏈反應（PCR)方法，即針對上述兩基因 設計兩對引物，會同此反應的其它試劑組合而成基因診斷試劑盒；
[0032] 步驟1，骨髓細胞模板DNA的提取：用小刀將患者骨髓涂片上的細胞刮下來，收集 于 1.5ml EP 管內，加入 TEN(15Mm Tris，15mM EDTA，15mM Nacl，ΡΗ8.0)液 500ul，10% SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55°C水浴中孵育5小時。
[0033] 步驟2,聚合酶鏈反應（PCR)條件：模板變性條件為97°C，7分鐘，32個循環，每個 循環中變性條件為94°C 5分鐘，退火條件為52°C，1分鐘，延伸條件為72°C，2分鐘，最后一 次循環之后延伸時間為5分鐘，取出置于4°C保存。
[0034] PCR產物的檢測：1. 8%瓊脂糖凝膠電泳，每孔點樣品（PCR產物）IOul，60V，30mA， 電泳20-25分鐘，EB染色，紫外燈下觀察結果。
[0035] PCR檢測結果：
[0036] 對32例MDS和12例可疑MDS作PCR檢測結果如下：（I) RA和可疑RA有其特殊的 PCR產物電泳帶型即4條大小不同的條紋，如圖2所示，其為PCR產物電泳圖A，顯示RA和 RAEB，有4條帶紋；圖3為本發明的PCR產物電泳圖B，顯示AA (再障）無帶紋，其母親有兩 條較小的帶紋。
[0037] (2)典型再障（AA)和ITP均無帶紋；
[0038] (3)可疑AA有1-2條帶，與早期紅血病相似；
[0039] (4)少數ITP和溶貧（HA)有1-2條帶紋；
[0040] (5)正常人和巨幼貧（MA)無帶；其他貧血病和出血病均無此帶型。表明其高度的 特異性。
[0041] 表1 44例MDS和可疑MDS患者骨髓檢查結果
[0042]
[0043] 注：*含4例+8而PCR均陰性者，扣除此4例，其PCR陽性率應為87. 5%，表中少 數病例未做S⑶或核型分析。
[0044] 本發明的試劑盒的適應癥：1，骨髓增生異常綜合癥（MDS) ;2,骨髓增殖性腫瘤 (MPN) ;3,急性白血病完全緩解（AL-CR) ;4,多種腫瘤早期（重度增生）。
[0045] 本發明試劑盒的規格：2ml和20ml兩種。具有10人份，50人份和100人份，三種。
[0046] 用法用量：
[0047] 靜脈注射：每公斤體重1-3單位，1次/日X3為一個療程；
[0048] 局部注射：每公分瘤體直徑1-2單位，1次/日X3為一個療程。
[0049] 試劑盒的保存期：冰箱（4°C )，保存3個月。采用玻璃安培包裝。
[0050] 結果判斷：
[0051] 1，對致病基因檢測呈陽性反應且有高考貝數擴增者，視為白血病前期或 MDS-RA (S)，或癌早期；
[0052] 2,對致病基因和癌變基因呈雙陽性反應且有高考貝數擴增者，視為高危MDS或急 性白血病，或原位癌；
[0053] 3,對僅有癌變基因呈陽性反應者，應除外白前和癌前。
[0054] 以上所述僅為本發明的較佳實施例，對發明而言僅僅是說明性的，而非限制性的。 本專業技術人員理解，在發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改， 甚至等效，但都將落入本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種癌癥早期基因診斷試劑盒，其特征在于，試劑盒包含致病基因和癌變基因兩對 PCR引物； 其中，V-erbBPCR引物序列如下： Pl:5'CACTGTGTGAAGGCCTGC3' ； P2 :5YTTATAAATAGTGCCAAAAGC3' ； TS引物序列根據TS基因編碼區隨機設計。2. -種癌癥早期基因診斷試劑盒的診斷方法，其特征在于，采用聚合酶鏈反應方法，即 針對上述兩個癌基因設計兩對引物，會同其它試劑組合而成基因診斷試劑盒； 步驟1，骨髓細胞模板DNA的提取：用小刀將患者骨髓涂片上的細胞刮下來，收集于 1.5mlEP管內，加入TEN(15MmTris，15mMEDTA，15mMNacl，PH8.0)液 500ul，10%SDS 75ul，蛋白酶K(2.0mg/ml)10ul，于55°C水浴中孵育5小時。 步驟2,聚合酶鏈反應條件：模板變性條件為97°C，7分鐘，32個循環，每個循環中變性 條件為94°C5分鐘，退火條件為52°C，1分鐘，延伸條件為72°C，2分鐘，最后一次循環之后 延伸時間為5分鐘，取出置于4°C保存。
【專利摘要】本發明涉及一種癌癥早期基因診斷試劑盒及診斷方法，使用檢測癌癥致病基因和癌變基因擴增的兩對引物，以疑似MDS或癌癥早期的骨髓或癌組織DNA作模板，在定量PCR儀器上作PCR反應。根據此PCR特異性陽性反應與否及強度，判斷該患者是否系MDS或早MDS，或癌前期。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN104928358
【申請號】CN201510076089
【發明人】馮寶章
【申請人】馮寶章
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年2月13日