生物素化熒光素酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及生物素化熒光素酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]生物素化(b1tinylat1n)是指將生物素共價連接到蛋白質、核酸或其它分子上的過程。由于生物素的分子量不大(分子量為244.31)，生物素化反應快速、高效且不易被干擾。生物素化的分子能通過生物素與鏈霉親和素、親和素互作，且不受高熱、pH、蛋白酶解的影響。生物素與鏈霉親和素、親和素的結合特異且高效，因此這一互作在生物技術的許多領域有著廣泛的應用。另外，多個生物素化分子可以發生交聯來形成個科研人員感興趣的蛋白，同時允許和多個鏈霉親和素、親和素、中性親和素蛋白結合，增加了對此蛋白的檢測靈敏度。此外還有大量的生物素化分子的應用有待開發。
[0003]熒光素酶(Luciferase)是自然界中能夠產生生物熒光的酶的統稱，其中最有代表性的是一種學名為Photinus pyrali’的螢火蟲體內的熒光素酶。在相應化學反應中，熒光的產生是來自于熒光素的氧化，有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷。沒有熒光素酶的情況下，熒光素與氧氣反應的速率非常慢，而鈣離子的存在常常可以進一步加速反應。
[0004]熒光素酶被生物素修飾之后就可以同親和素進行固相親和作用。生物素與親和素是一對特異性相當高的親和配體，并且具有解離速率慢、不易受干擾等特點。目前，生物素化的手段有化學修飾和生物修飾，但修飾后的生物素化蛋白活性普遍不高。生物素化的熒光素酶可應用于焦磷酸測序反應中，酶活會直接影響到測序反應的準確度，所以急需找到一種可操作性強，產物活性高的制備方法。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是一種生物素化熒光素酶的制備方法，包括以下步驟:
(1)使用PBS緩沖液溶解熒光素酶；
(2)活化生物素；
(3)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶，按照生物素與熒光素酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液；
(4)使用PBS緩沖液對混合溶液進行透析，去除雜質和游離生物素；
(5)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(6)加入保護劑，冷藏保存。
[0006]所述PBS緩沖液pH值為7.4。
[0007]所述溶解熒光素酶，使熒光素酶濃度為1.5-2mg/mlo
[0008]所述活化生物素使用DCC/NHS和有機溶劑，生物素、DCC和NHS的摩爾比為2:3: 3，有機溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。
[0009]所述攪拌溫度為4°C，持續5小時以上，優選為8小時。
[0010]所述透析過程溫度為4°C，持續12小時以上，優選為18小時。
[0011]所述透析過程，PBS緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，PBS緩沖液更換一次以上。
[0012]所述保護劑含有PBS緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
[0013]所述保護劑優選含有PBS緩沖液、甘氨酸、組氨酸、DTT、EDTA和疊氮鈉。
[0014]本發明中二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑能夠使生物素和熒光素酶溶解于其中，在其中高效、充分的結合。制備得到的生物素化熒光素酶，非常適合應用于焦磷酸測序反應中，熒光素酶的高活性可確保測序反應的準確度。在測序反應中，可與焦磷酸酶和ATP硫化酶協同作用，進行通量高、讀長大的測序反應。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為1.8mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入IL分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.24mol溶于由10ml 二甲基甲酰胺和80ml四氫呋喃混合得到的混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌8小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對10ml混合溶液進行透析，持續18小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，PBS緩沖液在6小時更換一次；
(5)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(6)加入酶體積2倍的保護劑，保護劑含有1mMPBS緩沖液、20%甘氨酸、30%組氨酸、0.15mM DTT,0.08mM EDTA 和 0.06mM 疊氮鈉，冷藏保存。
[0016]實施例2
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為1.5mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.22mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌5小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對80ml混合溶液進行透析，持續12小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，PBS緩沖液在4小時更換一次；
(5)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(6)加入酶體積1.5倍的保護劑，保護劑含有1mM PBS緩沖液和0.1mM DTT，冷藏保存。
[0017]實施例3
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為1.6mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.25mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌6小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對90ml混合溶液進行透析，持續15小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，PBS緩沖液在4小時和8小時更換；
(5)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(6)加入酶體積2倍的保護劑，保護劑含有1mMPBS緩沖液、20%甘氨酸、0.2mM甘露醇、0.15mM DTT 和 0.08mM EDTA，冷藏保存。
[0018]實施例4
(1)使用PH7.4的PBS緩沖液溶解熒光素酶，熒光素酶濃度為2mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.5mol DCC, 1.5mol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)將活化的生物素0.23mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶0.0lmol，混合，攪拌7小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(4)使用ILPBS緩沖液對85ml混合溶液進行透析，持續13小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，PBS緩沖液在2小時和9小時更換；
(5)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(6)加入與酶等體積的保護劑，保護劑含有1mMPBS緩沖液、25%甘氨酸、0.15mM DTT和0.2mM聚乙二醇，冷藏保存。
【主權項】
1.一種生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)使用PBS緩沖液溶解熒光素酶； (2)活化生物素； (3)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入熒光素酶，按照生物素與熒光素酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液； (4)使用PBS緩沖液對混合溶液進行透析，去除雜質和游離生物素； (5)使用280nm的吸光度測定蛋白含量； (6)加入保護劑，冷藏保存。2.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述PBS緩沖液PH值為7.4。3.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述溶解熒光素酶，使熒光素酶濃度為1.5-2mg/ml。4.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述活化生物素使用DCC/NHS和有機溶劑，生物素、DCC和NHS的摩爾比為2:3: 3，有機溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。5.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述攪拌溫度為40C，持續5小時以上，優選為8小時。6.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述透析過程溫度為4°C，持續12小時以上，優選為18小時。7.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述透析過程，PBS緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，PBS緩沖液更換一次以上。8.如權利要求1所述的生物素化熒光素酶的制備方法，其特征在于，所述保護劑含有PBS緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及生物素化熒光素酶的制備方法。包括以下步驟：（1）使用PBS緩沖液溶解熒光素酶；（2）活化生物素；（3）將活化的生物素溶于混合溶劑中，加入熒光素酶，攪拌；（4）使用PBS緩沖液對混合溶液進行透析（5）使用280nm的吸光度測定蛋白含量；（6）加入保護劑，冷藏保存。得到的生物素化熒光素酶生物活性高。
【IPC分類】C12N9/02
【公開號】CN104928264
【申請號】CN201510417159
【發明人】高靜, 蔡亦梅, 徐瀟, 吳超, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風
【申請人】北京中科紫鑫科技有限責任公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月16日