斑籽素的制備方法及其在抗白血病藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明公開了一種植物提取物的制備方法及應用，特別涉及斑籽素的制備方法及 其在抗白血病藥物中的應用。
[0002]
【背景技術】
[0003] 斑籽素（Baliospermin)，分子式為C32H5tlO8，分子量為562. 74,結構式為
斑好素來源于大戟科（Euphorbiaceae)山斑軒Baliospermummontanum(Wilid.)Muell. -Arg.的根。斑籽素具有抗癌作用。對P388淋巴細胞白血病體內0. 2mg/kg時, T/C為131。體外試驗對P388的ED50為0. 6yg/mL。
[0004] 白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病細胞因為增殖失控、分 化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤其他組織和器官， 同時正常造血受抑制。臨床可見不同程度的貧血、出血、感染發熱以及肝、脾、淋巴結腫大和 骨骼疼痛。據報道，我國各地區白血病的發病率在各種腫瘤中占第六位。
【發明內容】
[0005] 為滿足臨床需要，擴大用藥品種，更好地治療癌癥，提供一種斑籽素的制備方法及 其在抗白血病藥物中的應用。
[0006] 為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案： 斑籽素的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取山斑籽根粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次0. 5~1. 5h，過 濾，合并提取液，濃縮至無醇，得濃縮液； 2) 將上述濃縮液加入至聚酰胺樹脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脫，收集洗脫液，回收 溶劑至干，得斑籽素粗提物； 3 )將上述斑籽素粗提物采用高速逆流色譜儀分離，收集洗脫液，濃縮，低溫干燥得斑籽 素。
[0007] 所述步驟2)中的聚酰胺樹脂粒度為80~120目，用量與藥材量的體積重量比為1 : 1_3 〇
[0008] 所述步驟2)中的酸醇是含1%乙酸的30~50%乙醇溶液。
[0009] 所述步驟3)中的高速逆流色譜儀的參數設定為：轉速750~1050r/min，流動相的 流速 2~10ml/min〇
[0010] 所述制備的斑籽素，在制備抗白血病藥物中的應用，尤其在制備防治淋巴性白血 病和髓細胞白血病的應用。
[0011] 所述制備的斑籽素，在其口服配方中添加腸吸收促進劑，包含中鏈脂肪酸鹽、膽酸 鹽、鵝去氧膽酸鹽、殼聚糖及其衍生物中的一種或幾種。
[0012] 采用本法制備斑籽素，工藝簡便易操作，制備量大，產品得率高，而且低污染；添加 腸吸收促進劑，有利于提高生物利用度。
[0013] 下面將結合【具體實施方式】進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限 于下列實施方式。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1: 斑籽素的制備 取山斑籽根lkg，粉碎，加入4L40%乙醇回流提取4次，每次I. 5h，固液分離得提取液， 濃縮至無醇味，取350g80目的聚酰胺樹脂，裝柱，濃縮液上柱，用8BV的含1%乙酸的30%乙 醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按3:1:4體積比置于分液漏 斗中混勻，靜置分層，分離上下相，取上相為固定相，下相為流動相，將斑籽素粗提物用下相 溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，以2ml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣， 控制轉速為750r/min，收集流出液，濃縮，低溫干燥得斑籽素，檢測含量99. 3%。
[0015] 實施例2: 斑籽素的制備 取山斑籽根5kg，粉碎，加入10L20%乙醇回流提取0. 5h，固液分離得提取液，濃縮至無 醇味，取5kgl20目的聚酰胺樹脂，裝柱，濃縮液上柱，用4BV的含1%乙酸的50%乙醇洗脫， 洗脫液回收溶劑，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按7:3:10體積比置于分液漏斗中混 勻，靜置分層，分離上下相，取上相為固定相，下相為流動相，將斑籽素粗提物用下相溶解， 開啟制備型高速逆流色譜儀，以3. 5ml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣，控制 轉速為1050r/min，收集流出液，濃縮，低溫干燥得斑籽素，檢測含量99. 1%。
[0016] 實施例3: 斑籽素的制備 取山斑籽根l〇kg，粉碎，加入80L30%乙醇回流提取2次，每次lh，固液分離得提取液， 濃縮至無醇味，取6kg80目的聚酰胺樹脂，裝柱，濃縮液上柱，用6BV的含1%乙酸的45%乙 醇洗脫，洗脫液回收溶劑，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按6:2:7體積比置于分液漏 斗中混勻，靜置分層，分離上下相，取上相為固定相，下相為流動相，將斑籽素粗提物用下相 溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，以lOml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣， 控制轉速為900r/min，收集流出液，濃縮，低溫干燥得斑籽素，檢測含量98. 5%。
[0017] 實施例4: 斑籽素的其在抗白血病藥物中的應用 1、材料 動物：昆明種小鼠，雌雄各半性，體重20±2g，由南京中醫藥大學提供。
[0018] 細胞株：P388 (白血病）細胞株，由中國科學院上海藥物研宄所提供。
[0019] 2、方法 在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，將被試細胞調成密度為2XIO4細胞/ml。 將上述細胞株懸液接種于96孔培養板，每孔50耵，置于飽和濕度、37 °C和5%C02培養箱中培 養24小時。分別加入溶劑對照0. 1%二甲基亞砜、陽性對照順鉑（DDP)以及不同濃度單體 化合物的二甲亞砜溶液各50沿，每組設3個復孔。培養72小時，于培養結束前4小時，各培 養孔加入5mg/ml四唑翁鹽（MTT) 10耵，置于飽和濕度、37°C和5%C02培養箱中培養4小時， 每孔中加入150耵二甲亞砜，振蕩溶解生成MTT晶體甲臜，用酶標儀測570nm0.D值，細胞存 活率由樣品0.D值對于對照品0.D值的比值計算。其中，斑籽素對P388細胞的半數抑制濃 度（IC5tl)有劑量效應曲線得到。
[0020] 3、結果 實現結果(見表1)本發明斑籽素對P388細胞的生長有明顯的抑制作用，其對P388細 胞的生長抑制活性強于陽性對照順鉑（DDP)，說明斑籽素具有極佳的抗白血病的活性，在制 備抗白血病藥物中有良好的應用前景。
【主權項】
1. 斑籽素的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 取山斑籽根粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次0. 5~1. 5h，過 濾，合并提取液，濃縮至無醇，得濃縮液； 2) 將上述濃縮液加入至聚酰胺樹脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脫，收集洗脫液，回收 溶劑至干，得斑籽素粗提物； 3 )將上述斑籽素粗提物采用高速逆流色譜儀分離，收集洗脫液，濃縮，低溫干燥得斑籽 素。2. 根據權利要求1所述的斑籽素的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的聚酰胺樹脂 粒度為80~120目，用量與藥材量的體積重量比為1 :1-3。3. 根據權利要求1所述的斑籽素的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的酸醇是含 1%乙酸的30~50%乙醇溶液。4. 根據權利要求1所述的斑籽素的制備方法，其特征在于所述步驟3)中的高速逆流色 譜儀的參數設定為：轉速750~1050r/min，流動相的流速2~10ml/min。5. 根據權利要求1~4所述方法制備的斑籽素，在制備抗白血病藥物中的應用。6. 根據權利要求5所述在制備抗白血病藥物中的應用，其特征在于在制備防治淋巴性 白血病和髓細胞白血病的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種植物提取物的制備方法及應用，尤其涉及斑籽素的制備方法及其在抗白血病藥物中的應用。制備方法包括以下步驟：取山斑籽根粉碎，采用低濃度醇回流提取，提取液濃縮至無醇，上聚酰胺樹脂柱吸附，酸醇洗脫，洗脫液回收溶劑，再采用高速逆流色譜法純化，收集流出液，濃縮，低溫干燥得高純度的斑籽素。采用本發明制備方法，工藝操作簡便、得率高，污染小，適合高純度斑籽素的生產。斑籽素具有抗腫瘤作用，藥理實驗表明斑籽素在抗腫瘤方面有很好的效果，尤其是對人淋巴細胞白血病<u/>(P388)效果更佳，可用于制備抗白血病藥物。
【IPC分類】C07D303/17, C07D301/32, A61K31/336, A61P35/02
【公開號】CN104926758
【申請號】CN201510262704
【發明人】劉東鋒, 楊成東
【申請人】南京澤朗醫藥科技有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月22日