一種吉利柘樹素a的提取分離方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種吉利柘樹素 A的提取分離方法與應用，具體是涉及一種應用高速 逆流色譜技術從柘樹莖皮中分離純化吉利柘樹素 A的方法，還涉及吉利柘樹素 A在抗腫瘤 藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 吉利柘樹素 A (Gericudranin A)，是一種黃酮醇類化合物，分子式：C29H24O9,分子 量：516. 5,黃色粉末，mpl35°C。主要存在于桑科（Moraceae)柘樹 iriciAspit/aia Bureau的莖皮中。
[0003] 現代藥理研宄表明，吉利柘樹素 A具有細胞毒活性。對人型腫瘤細胞的ED5tl ( μ g/ ml)為皮膚癌CRL1579為3. 65,皮膚癌LOX-MVI為11. 99,白血病M0LT-4F為2. 65,結腸癌 KM12 為 13. 70,腎癌 U0-31 為 6. 99。
[0004] 現有提取吉利柘樹素 A的報道并不多見，市場上也尚未有吉利柘樹素 A對照品的 出售，因此提供一種吉利柘樹素 A的提取分離方法與應用則很有必要，可以為其后續研宄 提供支持。
[0005] 本發明的目的是提供一種吉利柘樹素 A的提取分離方法與應用，本發明方法制得 的吉利柘樹素 A質量好，純度高。
[0006] 為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案： 一種吉利柘樹素 A的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取：將柘樹莖皮粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混懸 20-40min，進行負壓空化混懸固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔樹脂富集：萃取液回收乙醇得浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶 液洗脫，收集吉利柘樹素 A流分，濃縮得吉利柘樹素 A粗品； (3) 純化：將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系 統，ELSD檢測器監測，收集目標流分，回收試劑，真空干燥得產品。
[0007] 步驟（1)所述乙醇水溶液濃度為75%，用量為10倍藥材重量。
[0008] 步驟（1)所述混懸時間為30min，萃取2次。
[0009] 步驟（2)所述萃取液濃縮至密度1. 1-1. 2g/ml。
[0010] 步驟（2)所述大孔樹脂為DlOl型，醇水溶液為85%的乙醇溶液。
[0011] 步驟（3 )所述氯仿-甲醇-水體積比為（5-9 ) : (15-17 ) : (6-8 )。
[0012] 本發明提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應用。
[0013] 本發明提取分離方法制得的化合物進行抗腫瘤活性實驗表明：該化合物具有較強 的抗腫瘤活性，在天然新藥開發中具有良好的應用前景。
[0014] 本發明提取分離方法制得的吉利柘樹素 A采用MTT法（四甲基偶氮唑鹽微量酶反 應比色法）進行抗腫瘤活性測試。
[0015] 試驗用細胞株： HeLa :人子宮頸癌細胞株；HEC-I :人子宮內膜癌細胞株；T-98和U251-SP :人腦神經膠 質瘤細胞株；HLE :人肝癌細胞株；MMl-CB和HMV-I :人黑色素瘤細胞株。
[0016] 方法：（1) 0. 25%胰酶消化對數生長期細胞，10%NBS的RPMI 1640調細胞濃度 50000個/ml。96孔板IOOul/孔。設溶劑對照，每組3平行孔。37°C，5%C0 2、95%空氣的 培養箱中預培養24h，棄上清。
[0017] (2)加藥物5個10倍稀釋的濃度(溶劑為有二甲亞砜和水），為KT4 mol/L。
[0018] (3)細胞連續培養48h，每孔加入10 μ I 5mg/ml的MTT溶液（以無血清培養基配 制)，繼續培養4h。
[0019] (4)吸去上清。加入200 μ1 DMS0,輕輕振蕩以使甲臜完全溶解。570nm處用酶標 儀測定OD值。
[0020] (5)計算抑制率（%)=(對照OD-藥物0D) /對照0D*100% 實驗結果：本發明化合物的抑制率以相對于對照(添加 DMS0)的結果如下表1表示。
[0021] 表1吉利柘樹素 A的腫瘤細胞增值抑制率％
以上試驗表明，吉利柘樹素 A具有良好的抑制腫瘤細胞生長的活性，其可在制備抗腫 瘤藥物中得到應用。
[0022] 本發明為制備抗腫瘤藥物提供了一種新的選擇。
[0023] 本發明所述吉利柘樹素 A在制備抗腫瘤藥物時，可按照常規的制劑方法以吉利柘 樹素 A為藥物活性成分，添加適宜的藥物載體，制成各種藥物劑型，如片劑、膠囊、滴丸、注 射劑、緩控釋劑等等。
[0024] 在用于治療腫瘤疾病時，口服制劑的用量一般可控制在每日服用吉利柘樹素 A200-500mg。其他劑型的用量可參考該用量。本發明的藥物用法用量，也不完全限于此，臨 床醫師也可以根據病人的具體情況決定藥物的用法用量。
[0025] 下面將結合【具體實施方式】進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限 于下列實施方式。
[0026]
【具體實施方式】： 實施例1 : 取柘樹莖皮lkg，粉碎成粗粉，與10kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進行負 壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大 孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用6倍柱體積的85%的乙醇溶液洗脫，薄層檢 測，收集目標流分，濃縮得粗品。
[0027] 取氯仿-甲醇-水按（5:15:6)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層作 為固定相，下層作為流動相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定相 泵入色譜柱中，再以4ml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣，控制轉速為850r/ min，ELSD檢測器監測，收集流出液，濃縮，干燥得吉利柘樹素 A，檢測含量96. 4%。
[0028] 實施例2 : 取柘樹莖皮2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進行負 壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大 孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用5倍柱體積的85%的乙醇溶液洗脫，薄層檢 測，收集目標流分，濃縮得粗品。
[0029] 取氯仿-甲醇-水按（9:17:8)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層 作為固定相，下層作為流動相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定 相泵入色譜柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣，控制轉速為 900r/min，ELSD檢測器監測，收集流出液，濃縮，干燥得吉利柘樹素 A，檢測含量97. 2%。
[0030] 實施例3 : 取柘樹莖皮2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進行負 壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. lg/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大 孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用6倍柱體積的85%的乙醇溶液洗脫，薄層檢 測，收集目標流分，濃縮得粗品。
[0031] 取氯仿-甲醇-水按（7:16:7)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層作 為固定相，下層作為流動相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定相 泵入色譜柱中，再以4ml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣，控制轉速為1000 r/ min，ELSD檢測器監測，收集流出液，濃縮，干燥得吉利柘樹素 A，檢測含量97. 0%。
[0032] 實施例4 : 取柘樹莖皮2kg，粉碎成粗粉，與20kg75%的乙醇溶液混合后，空化混懸30min，進行負 壓空化混懸固液萃取2次，得到萃取液，濃縮至密度I. 2g/ml，得浸膏，向浸膏中加 DlOl型大 孔樹脂拌勻、干燥后裝柱，先用水洗至色淺，再用5倍柱體積的85%的乙醇溶液洗脫，薄層檢 測，收集目標流分，濃縮得粗品。
[0033] 取氯仿-甲醇-水按（8:15:7)體積比置于分液漏斗中，混勻后，靜置，放出上層 作為固定相，下層作為流動相，將粗品用下相溶解，開啟制備型高速逆流色譜儀，先將固定 相泵入色譜柱中，再以3. 5ml/min流速泵入流動相，并通過進樣閥連續進樣，控制轉速為 950r/min，ELSD檢測器監測，收集流出液，濃縮，干燥得吉利柘樹素 A，檢測含量96. 3%。
[0034] 實施例5 : 本發明藥物顆粒劑 將實施例1所制吉利柘樹素 A加入乙醇作黏合劑，加入淀粉作填充劑，制成顆粒。
[0035] 實施例6 : 本發明藥物片劑 將實施例1所制吉利柘樹素 A，加入淀粉、糊精、硬脂酸鎂等，混合制成濕粒，壓片，每片 含吉利柘樹素 A200mg。
【主權項】
1. 一種吉利柘樹素A的提取分離方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 提取：將柘樹莖皮粉碎，加入7-12倍藥材重量的70-90%乙醇水溶液，空化混懸 20-40min，進行負壓空化混懸固液萃取1-2次，得到萃取液； (2) 大孔樹脂富集：萃取液回收乙醇得浸膏，加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶 液洗脫，收集吉利柘樹素A流分，濃縮得吉利柘樹素A粗品； (3) 純化：將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化，以氯仿-甲醇-水為兩相溶劑系 統，ELSD檢測器監測，收集目標流分，回收試劑，真空干燥得產品。2. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（1)所述乙醇水溶液濃度為 75%，用量為10倍藥材重量。3. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（1)所述混懸時間為30min，萃 取2次。4. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（2)所述萃取液濃縮至密度 I. 1-1. 2g/ml〇5. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（2)所述大孔樹脂為DlOl型， 醇水溶液為85%的乙醇溶液。6. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于步驟（3)所述氯仿-甲醇-水體積 比為（5-9) : (15-17) : (6-8)。7. 如權利要求1~6所述提取分離方法制得的化合物在抗腫瘤藥物中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種吉利柘樹素A的提取分離方法與應用，提取分離方法包括以下步驟：（1）將柘樹莖皮粉碎，加入乙醇水溶液，進行負壓空化混懸固液萃取，得到萃取液，萃取液回收試劑得浸膏；（2）浸膏加入大孔樹脂，拌勻、干燥后裝柱，醇水溶液洗脫，收集吉利柘樹素A流分，濃縮得吉利柘樹素A粗品；（3）將上述粗品采用高速逆流色譜法分離純化得吉利柘樹素A。本發明方法具有所得產品含量高，操作簡單，提率高等優點。本發明方法所制化合物為開發應用新一代天然來源的抗腫瘤藥物開拓了新徑。
【IPC分類】C07D311/40, C07D311/32, A61P35/00
【公開號】CN104910120
【申請號】CN201510264459
【發明人】劉東鋒, 楊成東
【申請人】南京澤朗醫藥科技有限公司
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月22日