用于白血病染色體畸變高通量測序的dna靶向捕獲陣列的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種用于白血病染色體畸變高通量測 序的DNA靶向捕獲陣列。
【背景技術】
[0002] 隨著分子細胞遺傳學技術的發展，已經證實某些染色體的特異性改變與白血病的 發生發展以及預后有著密切的關系。染色體異常的檢測為白血病的臨床診斷、分期、治療、 預后的判斷以及微小殘留病變的治療提供重要依據。
[0003] 目前，國內外對于白血病染色體畸變的檢測采用高分辨率的顯帶技術、熒光原位 雜交技術（FISH)等，染色體顯帶技術（chromosome banding technology)指借助特殊的 處理程序，使染色體的一定部位顯示出深淺不同的染色體帶紋。這些帶紋具有物種及染 色體的特異性，可更有效地鑒別染色體和研宄染色體的結構和功能。熒光原位雜交技術 (fluorescence in situ hybridization，FISH)，是根據已知的特異的DNA序列，以利用焚 光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與被檢測的染色體的DNA分子雜交，如果被檢測 的染色體上的靶DNA與所用的探針是同源互補的，即可形成靶DNA與探針的雜交體，經熒光 檢測體系檢測雜交信號；這些對技術操作和判讀都有較高要求，染色體熒光原位雜交探針 價格昂貴，且只針對單一位點；并且染色體技術只適用于檢測分裂相的細胞，分辨率較低， 結果的準確判讀需要長期的專業訓練。染色體熒光原位雜交技術雖然能檢測分裂期細胞和 分裂間期細胞，但其每次只能用一種已知探針檢出一種異常，漏檢率很高，且對技術操作 要求嚴格、費用較高。
[0004] 高通量測序又稱第二代測序，是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到 幾百萬條DNA片段進行序列測定。測序時將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃 表面（即Flow cell)，這些DNA片段經過延伸和橋式擴增后，在Flow cell上形成了數以 億計Cluster，每個Cluster是具有數千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的 四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的邊合成邊測序技術對待測的模板DNA進行測 序。目標序列捕獲測序技術是第二代測序結合微陣列技術而衍生出來的應用，這項技術首 先利用微陣列技術合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區域 互補結合，從而富集到特定區段，然后用第二代測序技術對這些區段進行測序。該技術為白 血病染色體畸變的檢測提供了合適的解決方法。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的不足，本發明提供一種用于白血病染色體畸變高通量靶向測 序的DNA捕獲陣列，對37個與診斷、預后和治療有關的白血病/淋巴瘤染色體畸變位點DNA 進行捕獲，用來進行高通量靶向測序的快速篩查，可以有效地一次性檢出37種染色體畸變。
[0006] 本發明所采用的技術方案是：一種用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測的 DNA陣列，該DNA陣列包含的探針特異性結合涉及37個染色體畸變的18個基因，所捕獲的 18個基因片段分別為：
[0007]
[0009] 37個白血病染色體畸變分別為：
[0010]
[0011]
[0012] 本發明的有益效果是：實現對與白血病相關的染色體易位進行快速的篩查；芯片 檢測一次可檢測多個樣本，費用較低；對待檢測的37個位點準確率接近100%;不需要細胞 遺傳學專業人員對結果進行判讀。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0014] 實施例1用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲測序的DNA陣列的設計
[0015] 米用Agilent SureSelect DNA Design Tool設計針對染色體畸變所涉及的18個 基因（見表2)的探針。參數設置如下：
[0016] Species :H. sapiens，hgl9, GRCH37, February2009 ;Databases :RefSeq，Ensembl， CCDS，Gencode，VEGA，SNP，
[0017] CytoBand ；Region ：Entire Transcribed Region ；Region Extension ： 10 bases from 3' end and 10 bases from 5' end ;Tiling density ：2X ；Masking ：Least Stringent ；Boosting ：Balanced.
[0018] 表2探針靶向捕獲的基因片段
[0019]
[0020] 實施例2使用本發明檢測臨床樣品
[0021] 1.提取骨髓或外周血標本提取基因組DNA。
[0022] 2.雜交前準備
[0023] 2. 1將基因組DNA打成幾百堿基的小片段建立文庫。
[0024] 2. 2 使用 Agencourt AMPure XP beads 對樣品進行純化。
[0025] 2. 3在DNA片段的3'端加堿基"A"。
[0026] 2. 4 使用 Agencourt AMPure XP beads 對樣品進行純化。
[0027] 2.5加雙末端接頭。
[0028] 2. 6 使用 Agencourt AMPure XP beads 對樣品進行純化。
[0029] 2.7擴增加接頭的文庫。
[0030] 2. 8 使用 Agencourt AMPure XP beads 對樣品進行純化。
[0031] 2.9評估文庫的質量。
[0032] 3.將該產品與建立的文庫進行雜交捕獲。
[0033] 4.將捕獲的DNA片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構。 添加未標記的dNTP和普通Taq酶進行固相橋式PCR擴增，單鏈橋型待測片段被擴增成為雙 鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補的單鏈，錨定到附近的固相表面。將擴增片段進行測 序，加入四種熒光標記的dNTP、DNA聚合酶以及接頭引物進行擴增，在每一個測序簇延伸互 補鏈時，每加入一個被熒光標記的dNTP就能釋放出相對應的熒光，測序儀通過捕獲熒光信 號，并通過計算機軟件將光信號轉化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。
[0034] 5.數據分析。將測序片段進行排列，與人參考基因組序列進行比對，找出易位的片 段。
[0035] 本發明用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲測序的DNA陣列由一系列100堿基 左右、序列部分重合的寡聚核苷酸組成，覆蓋300萬（3Mb)堿基的染色體畸變區域，共37個 靶點（見表1)。采用200倍測序覆蓋度（即平均每個靶序列測序200次），一個陣列檢測 25個樣品，陣列的總測序容量在15Gb。本發明選擇37個與白血病診斷分型、預后和治療 效果有關的染色體畸變（見表1)，針對其易位點建立靶向捕獲測序陣列。對于易位點附近 的靶序列，根據易位點是否相對固定，確定每個靶序列的大小，針對靶序列合成寡聚核苷酸 標簽，固定在芯片上制成陣列，與基因組特定區域互補達到"捕獲"，對捕獲的DNA序列進行 "邊合成邊測序"，再將測序結果的短片段進行排列，找出染色體易位的位點。
[0036] 表1 37個染色體畸變以及形成的融合基因
[0037]
[0038]
[0039] 本發明針對37個與診斷、預后和治療有關的白血病/淋巴瘤染色體易位，設計了 覆蓋這些易位點的靶向捕獲測序陣列。應用這個陣列，可以對白血病患者外周血或骨髓標 本的DNA進行靶向捕獲測序，對靶向測序的結果進行排列比對后，找出可能的染色體易位 點。本發明靶向測序捕獲的范圍為3Mb，以200倍覆蓋率進行邊合成邊測序，每次檢測25個 樣品，總數據量為15G(150億堿基）。
【主權項】
1. 一種用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測的DNA陣列，其特征在于，該DNA陣 列包含的探針特異性結合涉及37個染色體畸變的18個基因，所捕獲的18個基因片段分別 為：2. 根據權利要求1所述的用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測的DNA陣列，其 特征在于，所述37個白血病染色體畸變分別為：
【專利摘要】本發明公開了一種用于白血病染色體畸變高通量靶向捕獲檢測的DNA陣列，在本DNA陣列中，包含的探針能夠特異性靶向捕獲37個染色體畸變所涉及的18個基因。將樣品與本DNA陣列雜交靶向捕獲染色畸變所涉及的基因序列，然后對捕獲的序列進行測序，將測序的結果進行分析篩查出存在的染色體畸變類型。該DNA陣列包含的探針特異性結合涉及37個染色體畸變的18個基因，實現對與白血病相關的染色體易位進行快速的篩查；芯片檢測一次可檢測多個樣本，費用較低；對待檢測的37個位點準確率接近100％；不需要細胞遺傳學專業人員對結果進行判讀。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104894111
【申請號】CN201510248837
【發明人】李衛東, 楊付花
【申請人】李衛東
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月18日