一種分枝型mPEG的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學和蛋白質化學領域，特別涉及一種分枝型mPEG的制備方法。 技術背景
[0002] 近年來，越來越多的蛋白質，酶被應用于臨床治療，然而這些生物大分子具有如不 易吸收、體內降解、引起免疫反應等的缺點，不能直接作為藥物使用，但是經過聚乙二醇修 飾的生物大分子彌補這些缺點，而且，聚乙二醇具有良好的生物相容性，對人體無毒，所以 用其修飾蛋白質是當今新藥研發的熱門領域。例如，PEG-腺苷脫氨酶已獲FDA批準上市； PEG修飾的細胞因子已被制成，并且PEG修飾的GM-CSF(巨噬細胞集落刺激因子）顯示了兩 種不相關聯的生物學性質。
[0003] 分枝型mPEG的合成，目的是為了解決直連PEG-活性分子的活性降低的問題，在修 飾度相同的情況下，前者連接的PEG分子量會成倍增加，其一是擴大結合物分子的大小，延 長體內保留時間，其二是更加有效的避免被水解和引發免疫反應，所以，在有相同修飾度的 情況下，分支型PEG的修飾效果比直鏈PEG好很多。
[0004] 目前為止，分枝型PEG的合成方法有以下幾種：
[0005] 1.以mPEG-OH為起始原料，合成路線為：
[0007] 本路線缺陷在于成本高，有大量廢液產生；
[0008] 2.以mPEG-CHO為起始原料，合成路線為：
[0009]
[0010] 本路線缺陷在于產率很低，且難以純化；
[0011] 3.以mPEG-COOH為起始原料，合成路線為：
[0012]
[0013] 本路線缺陷在于反應條件難以控制，成本較高；
[0014] 上述合成路線的各種缺陷使得分枝型聚乙二醇價格昂貴，限制了其在科研和臨床 上的應用。
【發明內容】
[0015] 本發明公開了一種分枝型聚乙二醇的制備方法，目的是為了克服上述分枝型聚乙 二醇的各種缺陷。
[0016] 本發明公開的分枝型mPEG在結構上是兩個mPEG-COOH對鳥氨酸的縮合產物，具有 如下分子結構：
[0017]
[0018] 其合成步驟如下：
[0019] (1)制備羧甲基化的mPEG
[0020] 將mPEG溶于二氯甲烷中，滴加瓊斯試劑，室溫攪拌過夜，加水萃取，分液，收集有 機相，濃縮，得到羧甲基化的mPEG ;
[0021] (2)制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽
[0022] 將鳥氨酸鹽酸鹽溶于無水乙醇，滴加氯化亞砜，室溫攪拌過夜，濃縮除去剩余的氯 化亞砜和溶劑，得到鳥氨酸乙酯鹽酸鹽；
[0023] (3)制備分枝型mPEG
[0024] 將羧甲基化的mPEG和鳥氨酸乙酯鹽酸鹽加入到二氯甲烷中，加入三乙胺，DCC， 氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌過夜，過濾，濾液倒入乙醚中，得到白色沉淀，過濾，把濾餅 加入到2N NaOH水溶液中，室溫攪拌2小時，加入濃鹽酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2 遍，合并有機相，干燥，濃縮，得到粗產品，再用乙醇重結晶，得到白色分枝型mPEG。
[0025] 所述的氨基酸為鳥氨酸，所述的mPEG為相對分子量為600-20000之間的聚合物。
[0026] 本發明的方法制備的分枝型mPEG可用于修飾蛋白質等生物大分子，也可以修飾 小分子藥物。
[0027] 本發明具有以下特點：
[0028] 1、發明利用多肽合成原理，但只需保護鳥氨酸的羧基，無需保護氨基或者活化羧 基；
[0029] 2、反應條件溫和，操作簡單；
[0030] 3、所用原料和試劑便宜易得；
[0031] 4、總收率高，可達78%。
【附圖說明】
[0032] 圖1是分枝型mPEG的合成路線圖。
[0033] 下面通過實施例對本發明作進一步的描述，這些描述并不是對本
【發明內容】
作進一 步的限定。本領域的技術人員應理解，對本發明的技術特征所作的等同替換，或相應的改 進，仍屬于本發明的保護范圍之內。
[0034] 具體實施例方式
[0035] 實施例1，用本發明的方法制備一種分枝型mPEG，其步驟為：
[0036] 1、制備羧甲基化的mPEG
[0037] 將100g mPEG600溶于I. 5L二氯甲烷中，滴加瓊斯試劑，室溫攪拌過夜，加水萃取， 分液，收集有機相，濃縮，加入石油醚攪拌，析出固體，過濾得到為92g的mPEG600-C00H ;
[0038] 2、制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽
[0039] 將100g鳥氨酸鹽酸鹽溶于2. IL無水乙醇，滴加119g氯化亞砜，室溫攪拌過夜，濃 縮除去剩余的氯化亞砜和溶劑，得到l〇2g鳥氨酸乙酯鹽酸鹽；
[0040] 3、制備分枝型mPEG
[0041] 取步驟1所得到的mPEG600-C00H 80g和步驟2所得到的鳥氨酸乙酯鹽酸鹽9g加 入到500ml二氯甲烷中，加入6g三乙胺，7g DCC，IOg氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌過夜， 過濾，濾液倒入乙醚中，得到白色沉淀，過濾，把濾餅加入到2N NaOH水溶液中，室溫攪拌2 小時，加入濃鹽酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有機相，干燥，濃縮，得到粗產 品，再用乙醇重結晶，得到62g白色分枝型mPEG。
[0042] 實施例2,用本發明的方法制備一種分枝型mPEG，其步驟為：
[0043] 1、制備羧甲基化的mPEG
[0044] 將100g mPEG5000溶于I. 5L二氯甲烷中，滴加瓊斯試劑，室溫攪拌過夜， 加水萃取，分液，收集有機相，濃縮，加入石油醚攪拌，析出固體，過濾得到為90g的 mPEG5000-C00H ；
[0045] 2、制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽
[0046] 將100g鳥氨酸鹽酸鹽溶于2. IL無水乙醇，滴加119g氯化亞砜，室溫攪拌過夜，濃 縮除去剩余的氯化亞砜和溶劑，得到IOlg鳥氨酸乙酯鹽酸鹽；
[0047] 3、制備分枝型mPEG
[0048] 取步驟1所得到的mPEG5000-C00H 80g和步驟2所得到的鳥氨酸乙酯鹽酸鹽7g 加入到500ml二氯甲烷中，加入6g三乙胺，7g DCC，IOg氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌過 夜，過濾，濾液倒入乙醚中，得到白色沉淀，過濾，把濾餅加入到2N NaOH水溶液中，室溫攪拌 2小時，加入濃鹽酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有機相，干燥，濃縮，得到粗產 品，再用乙醇重結晶，得到58g白色分枝型mPEG。
[0049] 實施例3,用本發明的方法制備一種分枝型mPEG，其步驟為：
[0050] 1、制備羧甲基化的mPEG
[0051] 將100g mPEG 10000溶于I. 8L二氯甲烷中，滴加瓊斯試劑，室溫攪拌過夜， 加水萃取，分液，收集有機相，濃縮，加入石油醚攪拌，析出固體，過濾得到為93g的 mPEG10000-C00H ；
[0052] 2、制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽
[0053] 將100g鳥氨酸鹽酸鹽溶于2. IL無水乙醇，滴加119g氯化亞砜，室溫攪拌過夜，濃 縮除去剩余的氯化亞砜和溶劑，得到99g鳥氨酸乙酯鹽酸鹽；
[0054] 3、制備分枝型mPEG
[0055] 取步驟1所得到的mPEG10000-C00H 80g和步驟2所得到的鳥氨酸乙酯鹽酸鹽4g 加入到500ml二氯甲烷中，加入4g三乙胺，5g DCC，6g氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌過夜， 過濾，濾液倒入乙醚中，得到白色沉淀，過濾，把濾餅加入到2N NaOH水溶液中，室溫攪拌2 小時，加入濃鹽酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有機相，干燥，濃縮，得到粗產 品，再用乙醇重結晶，得到59g白色分枝型mPEG。
[0056] 實施例4,用本發明的方法制備一種分枝型mPEG，其步驟為：
[0057] 1、制備羧甲基化的mPEG
[0058] 將100g mPEG 20000溶于I. 8L二氯甲烷中，滴加瓊斯試劑，室溫攪拌過夜， 加水萃取，分液，收集有機相，濃縮，加入石油醚攪拌，析出固體，過濾得到為86g的 mPEG10000-C00H ；
[0059] 2、制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽
[0060] 將100g鳥氨酸鹽酸鹽溶于2. IL無水乙醇，滴加119g氯化亞砜，室溫攪拌過夜，濃 縮除去剩余的氯化亞砜和溶劑，得到97g鳥氨酸乙酯鹽酸鹽；
[0061] 3、制備分枝型mPEG
[0062] 取步驟1所得到的mPEG20000-C00H 80g和步驟2所得到的鳥氨酸乙酯鹽酸鹽3g 加入到500ml二氯甲烷中，加入3g三乙胺，4g DCC，4g氮-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌過夜， 過濾，濾液倒入乙醚中，得到白色沉淀，過濾，把濾餅加入到2N NaOH水溶液中，室溫攪拌2 小時，加入濃鹽酸至pH = 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并有機相，干燥，濃縮，得到粗產 品，再用乙醇重結晶，得到59g白色分枝型mPEG。
【主權項】
1. 一種分枝型mPEG的制備方法，其工藝步驟如下： (1) 制備羧甲基化的mPEG 將mPEG溶于二氯甲烷中，滴加瓊斯試劑，室溫攪拌過夜，加水萃取，分液，收集有機相， 濃縮，得到羧甲基化的mPEG; (2) 制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽 將鳥氨酸鹽酸鹽溶于無水乙醇，滴加氯化亞砜，室溫攪拌過夜，濃縮除去剩余的氯化亞 砜和溶劑，得到鳥氨酸乙酯鹽酸鹽； (3) 制備分枝型mPEG 將羧甲基化的mPEG和鳥氨酸乙酯鹽酸鹽加入到二氯甲烷中，加入三乙胺，DCC，氮-羥 基琥珀酰亞胺，室溫攪拌過夜，過濾，濾液倒入乙醚中，得到白色沉淀，過濾，把濾餅加入到 2NNaOH水溶液中，室溫攪拌2小時，加入濃鹽酸至pH= 3,然后用二氯甲烷萃取2遍，合并 有機相，干燥，濃縮，得到粗產品，再用乙醇重結晶，得到白色分枝型mPEG。2. 按權利要求1所述的分枝型聚乙二醇的制備方法，其特征在于，所述的氨基酸為鳥 氨酸。3. 按權利要求1所述的分枝型聚乙二醇的制備方法，其特征在于，所述的mPEG為相對 分子量為600-20000之間的聚合物。
【專利摘要】本發明公開了一種分枝型mPEG的制備方法，先分別以單甲氧基聚乙二醇為原料制備羧甲基化的mPEG和鳥氨酸鹽酸鹽為原料制備鳥氨酸乙酯鹽酸鹽，然后以兩者為原料經過縮合、水解反應，得到分枝型mPEG，既可修飾小分子藥物，也可以修飾大分子蛋白質，具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C08G65/48
【公開號】CN104892927
【申請號】CN201510253373
【發明人】不公告發明人
【申請人】湖南華騰制藥有限公司
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月18日