白鮮皮活性成分促進5-羥色胺受體增量表達的新功能的制作方法
【技術領域】
[0001]本申請屬于藥材活性成分新功能的技術領域，尤其涉及于一種分離于中藥材白鮮皮的活性成分可促進海馬神經元5-羥色胺受體增量表達的新功能。
【背景技術】
[0002]5-羥色胺又叫血清素，是一種抑制性神經遞質，其廣泛分布于各腦區，尤以大腦皮層居多。5-羥色胺是受到研宄最為廣泛的神經遞質，其參與人的情緒、記憶、精力等多種生命過程，其表達及功能的異常與多種神經系統疾病的發生密切相關，最主要的如精神分裂癥和抑郁狂躁型憂郁癥(bipolar disorders).5)777(74是一種重要的5-羥色胺受體亞型，在腦中分布廣泛，其參與到多種神經細胞的5-羥色胺的信號輸入過程，并在下游偶聯多種信號轉導途徑，以完成以遞質傳遞為基礎的抑制性神經活動。有研宄表明，5)777(74的減量表達與精神分裂癥和抑郁狂躁型憂郁癥的發生存在病例-對照實驗中的關聯性。
[0003]'^鮮{Dictamnus dascarpus Turcz.)，別名:蘚皮、野花椒根皮、臭根皮、北鮮皮，為蕓香科白鮮屬多年生草本植物，植物本身有特異香味。白鮮屬植物全世界約6種，主要分布于歐亞大陸，我國白鮮屬植物主要有白鮮和新疆白鮮。白鮮皮為白鮮的干燥根皮，為我國傳統中草藥，歷代本草及《中國藥典》2010版一部收載記錄其功能主治有清熱燥濕、祛風解毒。用于濕熱瘡毒，黃水淋漓，濕瘆，風瘆，疥癬瘡癩，風濕熱痹，黃疸尿赤。白鮮皮中的化學成分較為復雜，目前，從白鮮皮中已分離鑒定出的化學成分主要包括檸檬苦素類、生物堿、黃酮類、內酯類、倍半萜及其苷類等。其中檸檬苦素類和生物堿類物質被認為是生物活性物質。現代藥理學研宄表明，白鮮皮提取物具有抗菌、抗腫瘤、抗炎與抗變態反應、抗潰瘍、抗冠狀動脈粥樣硬化、保護肝臟和神經等作用，臨床上主要用治療慢性支氣管炎、皮膚脫皮癥、風濕性關節炎、外出血、蕁麻瘆等。但白鮮皮提取物對中樞神經系統的功能作用目前尚未見報道。
【發明內容】
[0004]白鮮皮為常用中藥材，其購自安徽省中醫院藥房。
[0005]白鮮皮活性成分的分離過程為:
將5-10 kg的白鮮皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小時，將提取液合并，濃縮得浸膏并加水混懸后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷提取成分約50g-100g，即為所述白鮮皮的活性成分。
[0006]所述白鮮皮活性成分的識別過程為:
取上述活性成分經硅膠柱層析分離得到四個分離峰，將第一個分離峰繼續進行Sedhadex LH-20柱色譜分析并進行重結晶。將所得峰分別進行質譜和核磁共振分析，其中一個分離峰根據E1-MS推測其分子質量為199，為奇數，可能為生物堿類化合物。IH-NMR(CDC13，600 MHz)波譜給出 δ 7.47 (1Η, t, J = 7.2 Hz, H-6)，7.71 (1H, t, J =7.2Hz, H-7), 8.29 (1H, d, J =8.4 Hz,H-5), 8.04 (1Η, d, J = 8.4 Hz, H-8)為偶合的苯環信號，4.48 (3H, s，-0CH3)為一個含氧取代的甲基信號，7.11(1? brs, H-3)，7.66(1H, brs, H-2)兩個烯碳質子信號。經檢索，光譜數據與文獻報道的白鮮堿(dictamnine)一致，故確定該化合物為白鮮堿(dictamnine)。因此本申請所述白鮮皮主要活性成分應為白鮮堿。
[0007]白鮮皮活性成分的生理活性檢測:
將出生24h內的SD大鼠處死并取海馬組織原代培養。將海馬組織放在200目篩網上，用眼科剪剪小塊過篩，經過100rpm離心8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培養基并加入10%胎牛血清，巴氏管吹打后種6孔板。培養條件為37°C5%水平的二氧化碳。每隔三天更換培養基。在培養至第7天時，向其中三孔的原代培養細胞加入終濃度為10 μM的上述白鮮皮提取物，另外三孔加入同樣體積的無菌水作為對照組。繼續培養至14天時，回收細胞。使用本領域常規的技術手段提取細胞中總mRNA、反轉錄為cDNA，并使用Cycle480 (Roche)熒光定量PCR儀(使用SybrGreen染料)對5)777(74的表達量進行定量分析。所使用的PCR條件為:95°C預變性5min，然后是95°C10s，60°C 10s，72°C 30s擴增共40個循環。所使用的引物為:上游GGCAACAACACCACAACG;下游TGACCGCCAAGGAGCCGATG。所獲得的定量數值為5HTR1A表達量與內參基因GAPDH的相對比值。
[0008]實驗組和對照組所獲得的mRNA相對定量結果如圖1所示。
[0009]從圖1中可以看出，經過白鮮皮活性成分的處理，5HTR1A基因的表達量有了明顯的提高，其表達量為對照組的1.7倍。
[0010]本申請首次證明了白鮮皮活性成分對大鼠中樞神經系統5-羥色胺能神經元的調節作用，該結果意味著該成分可以參與到人和哺乳動物的情感、記憶及精力等神經活動中，并對該活動施加影響，同時為精神分裂癥等精神疾病的治療提供了潛在的解決方案。
【附圖說明】
[0011]圖1白鮮皮提取物處理所引起的大鼠海馬神經元5HTR1A基因的表達變化。
[0012]Control指對照組；substances’ addit1n指白鮮皮提取物處理組；縱坐標為相對mRNA水平。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
白鮮皮活性成分的分離過程為:
將5 kg的白鮮皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小時，將提取液合并，濃縮得浸膏并加水混懸后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷提取成分約50g，即為所述白鮮皮的活性成分。
[0014]實施例2
將1kg的白鮮皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小時，將提取液合并，濃縮得浸膏并加水混懸后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷提取成分約100g，即為所述白鮮皮的活性成分。
[0015]實施例3
將8 kg的白鮮皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小時，將提取液合并，濃縮得浸膏并加水混懸后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷提取成分約80g，即為所述白鮮皮的活性成分。
[0016]實施例4
所述白鮮皮活性成分的識別過程為:
取上述活性成分經硅膠柱層析分離得到四個分離峰，將第一個分離峰繼續進行Sedhadex LH-20柱色譜分析并進行重結晶。將所得峰分別進行質譜和核磁共振分析，其中一個分離峰根據E1-MS推測其分子質量為199，為奇數，可能為生物堿類化合物。IH-NMR(CDC13，600 MHz)波譜給出 δ 7.47 (1Η, t, J = 7.2 Hz, H-6)，7.71 (1H, t, J =7.2Hz, H-7), 8.29 (1H, d, J =8.4 Hz,H-5), 8.04 (1Η, d, J = 8.4 Hz, H-8)為偶合的苯環信號，4.48 (3H, s，-0CH3)為一個含氧取代的甲基信號，7.11(1? brs, H-3)，7.66(1H, brs, H-2)兩個烯碳質子信號。經檢索，光譜數據與文獻報道的白鮮堿(dictamnine)一致，故確定該化合物為白鮮堿(dictamnine)。因此所述白鮮皮主要活性成分應為白鮮喊。
[0017]實施例5
白鮮皮活性成分的生理活性檢測:
將出生24h內的SD大鼠處死并取海馬組織原代培養。將海馬組織放在200目篩網上，用眼科剪剪小塊過篩，經過100rpm離心8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培養基并加入10%胎牛血清，巴氏管吹打后種6孔板。培養條件為37°C5%水平的二氧化碳。每隔三天更換培養基。在培養至第7天時，向其中三孔的原代培養細胞加入終濃度為10 μM的上述白鮮皮提取物，另外三孔加入同樣體積的無菌水作為對照組。繼續培養至14天時，回收細胞。使用本領域常規的技術手段提取細胞中總mRNA、反轉錄為cDNA，并使用Cycle480 (Roche)熒光定量PCR儀(使用SybrGreen染料)對5)777(74的表達量進行定量分析。所使用的PCR條件為:95°C預變性5min，然后是95°C10s，60°C 10s，72°C 30s擴增共40個循環。所使用的引物為:上游GGCAACAACACCACAACG;下游TGACCGCCAAGGAGCCGATG。所獲得的定量數值為5HTR1A表達量與內參基因GAPDH的相對比值。
【主權項】
1.一種分離于白鮮皮的活性成分，其特征在于，其分離方法為:10 kg的白鮮皮依次用95%的乙醇、70%乙醇10倍量回收提取三次，每次一小時，將提取液合并，濃縮得浸膏并加水混懸后，依次用石油醚、二氯甲烷及乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷提取成分約10gjP為所述白鮮皮的活性成分。2.一種如權利要求1所述活性成分的新功能，其特征在于，該成分的加入可促使大鼠海馬原代培養神經元的5-羥色胺受體基因5Z/77P7J增量表達，與對照組相比，5HTR1A%mRNA水平增加為原來的1.7倍。
【專利摘要】白鮮皮是一種重要的中藥材。本申請介紹白鮮皮活性成分的一種新功能，通過其對大鼠原代培養神經元的作用實驗，我們發現白鮮皮活性成分的加入能夠促進5-羥色胺受體基因5HTR1A的過量表達，由于5-羥色胺能神經元對情緒、記憶等行為有重要的影響，上述結果表明白鮮皮活性成分的使用可促進人體快感、長時程記憶等功能的變化。
【IPC分類】A61P25/18, C07D491/048, A61K31/4741, A61P25/28
【公開號】CN104892617
【申請號】CN201510265214
【發明人】不公告發明人
【申請人】徐毅
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年5月22日