辣椒萎黃病病毒檢測引物和探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于一種基于DNA體外擴增技術的植物病毒分子生物學檢測方法，涉及 針對布尼亞病毒科（Bunyaviridae)、番前斑萎病毒屬（Tospovirus)的辣椒萎黃病病毒 (Capsicum Chlorosis Virus)的檢驗檢疫和分子生物學研宄領域。
【背景技術】
[0002] 目前，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，簡稱PCR)技術(參見美國專 利4, 683, 195、4, 683, 202、4, 965, 188)在分子生物學研宄和檢測技術領域的應用非常普遍， 相關技術資料可以參考分子克隆-實驗手冊（Molecular Cloning-A Laboratory Manual， Cold SpringHarbor，New York)等文獻。
[0003] 辣椒萎黃病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV)感染前科植物，花生，蝴蝶蘭 (Phalaenopsis)等，是嚴重危害蘭花養殖業的RNA植物病毒之一。CaCV最先由臺灣學者發 現感染蝴蝶蘭，并很快被歐洲、澳大利亞等國列入蘭花貿易待檢病毒清單。CaCV最主要的病 征是在受到侵害的植株葉面位置產生黃化輪斑，但它并不導致全株植物組織帶毒。CaCV可 以但不易通過機械接種、嫁接、組織切片等方式傳播，這種病毒主要是通過薊馬以永續型方 式傳播。傳播CaCV的薊馬種類尚未澄清。
[0004] CaCV屬于番前斑萎病毒屬（Tospovirus)的第五血清群，或WSMoV血清組。病毒 粒子為球狀，直徑80~110nm，粒體外層由一層脂質包裹。病毒基因組屬于負單鏈RNA，由 L RNA、M RNA、和S RNA三個片段RNA組成。L RNA為大小約8. 92kb的負鏈、含單個開放 閱讀框架（0RF)，編碼依賴 RNA 的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase)。M RNA 和S RNA均為雙義RNA，有2個0RF，反向相連。M RNA大小約4. 82kb，編碼非結構蛋白 NSm (Nonstructural Protein NSm)和糖蛋白前體（Glycoprotein Precursor)。S RNA 大小約3.48kb，編碼非結構蛋白NSs (Non-structural Protein NSs)和核衣殼蛋白N (Nucleocapsid Protein)〇
[0005] 國內目前對CaCV的檢測主要以血清學方法和分子生物檢測法為主。血 清學方法包括免疫電鏡法（Immuno-specific Electron Microscopy, ISEM)、免疫 擴散法（SDS-immunodiffusion Test)、酶聯免疫吸附試驗（ELISA)、免疫斑點試驗 (Immunoblotting Test)、膠體金標記層析技術（Gold Immunochromatography Assay， GICA)等；分子生物檢測法包括斑點雜交法（Dot Hybridization)、印痕雜交法（Southern Blot或Northern Blot)、逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR)等。上述方法中，基于對檢測靈 敏度和快速簡單的要求，以RT-PCR最為適用并且在實際工作中應用最廣。RT-PCR法具有極 高的檢測靈敏度，非常適合于樣本的快速檢測要求。目前常用于對名貴花丼品種的檢查。
【發明內容】
[0006] 發明目的：本發明的目的就是提供一種適用性廣、特異性好、擴增效率高的引物和 探針序列，以便對CaCV進行簡易快速的田間檢測或實驗室檢測。
[0007] 本發明的原理如下：本發明以CaCV非結構蛋白（Nonstructural Protein)基因的 Ph segment S序列（GenBank: KC953852.1)為靶序列，通過序列比對找出具有高度相似度 的片段區間，通過序列分析排除二級結構和非特異性序列區間，最終篩選出的擴增片段位 于靶序列第3041~3277堿基，產物大小為237bp。
[0008] 本發明所涉及引物以及寡核苷酸探針的序列如下（自左至右按5'端到3'端方向 排列）： 上游引物：GGT GCA AGG CCT TTA ATG CTG GA 下游引物：GAG GAT TGG ACT TTT AAG AGA A 寡核苷酸探針：A TGT GCT CTC AGG ATG A 上述寡核苷酸探針的5'端可以增加一個5~25mer的poly(dT)結構，以便更高效地 將該寡核苷酸探針的5'端固定在載體表面并提高探針的雜交效率。
[0009] 本發明所涉及的引物可根據需要在引物的5'端標記上生物素（Biotin)、堿性磷 酸酶或辣根過氧化物酶等標記物并通過雜交技術進行檢測。
[0010] 用本發明引物對CaCV進行檢測時，病毒RNA樣品制備方法可見有關文獻。檢測 CaCVRT-PCR擴增產物的方法包括：（1)用瓊脂糖凝膠電泳法分析擴增產物；（2)用與互補寡 核苷酸探針雜交來進行檢測，包括DNA微陣列、斑點印跡法和反向斑點印跡法。上述所用的 具體實驗方法均不屬于本發明申請內容。
【具體實施方式】
[0011] 具體實施例一 病毒RNA逆轉錄反應（10 μ L的反應體系可用于逆轉錄1.0 ng~2.5 yg總RNA): (1)將以下組分加入無核酸酶的微量離心管中：上下游引物各I pmole，帶CaCV樣品總RNA 1 μ g，IOmM dNTP 混合物（dATP，dGTP，dCTP 和 dTTP 均為 10mM，pH 7. 0) 0· 5 μ 1，加入滅菌 蒸餾水至6 μ L ; (2)混合物在65°C加熱5分鐘后，迅速置于冰上冷卻，短暫離心后，加入以 下組分：5X第一鏈合成緩沖液2yL，0.1 M DTT I yL，40單位/yL RNasin 0· 5yL，在離 心管中輕輕將各種成分充分混合，并在37°C下孵育2分鐘；（3)在室溫下加入0.5 yL (200 單位/ μ L)逆轉錄酶，輕輕地吹打混勻，在37°C孵育50分鐘。
[0012] 具體實施例二 病毒RNA逆轉產物的PCR擴增： (1) 在0.211^?0?反應管中加入下列成分至終體積5(^1^1(^1^〇0嫩，5以1^10\?0? 緩沖液，1.5yL 50mM MgC12，lyL IOmM dNTP混合物，上游引物（10μΜ)和下游引物 (10 μ Μ)各1 μ L，Taq DNA聚合酶（5U/ μ L) 0· 5 μ 1，加滅菌蒸餾水至總體積50 μ L ; (2) PCR反應條件： 94°C, 2min 94°C，25s 60°C，25sj30 個循環 72 °C, 40s 72〇C,5min〇
[0013] 具體實施例三 寡核苷酸探針在雜交膜上的固定：（1)將5'端帶poly(dT) 15結構的寡核苷酸探針溶 于二甲基亞砜，探針終濃度為10~20 μΜ ; (2)把探針溶液點在雜交膜正表面；（3)把點有 探針的雜交膜放入紫外交聯設備中照射3~5min進行探針固定；（4)把雜交膜浸入蒸餾水 洗滌，然后放入50°C烘箱干燥IOmin備用。
[0014] 具體實施例四 雜交顯色反應：（1)操作前先將雜交緩沖液（20mM Tris-HCl，50mM KC1，pH8. 4)預熱到 室溫，將雜交儀預熱到42°C; (2)用PCR儀將PCR反應產物加熱至99°C、7min然后快速冷卻 至4°C、3min，使DNA解鏈，然后置于冰上暫時存放；（3)取10 μ L經過解鏈處理的PCR反應 產物與100 μ L經過預熱的雜交緩沖液充分混合，將混合液加到固定了探針的雜交膜表面， 用雜交盒密封后置于雜交儀于45°C雜交2hr，用去離子水充分洗滌；（4)將雜交膜浸入含1% BSA的磷酸緩沖液（pH 8. 0)，于37°C反應30分鐘，用去離子水充分洗滌；（5)加入100 μ L鏈 霉親和素-堿性磷酸酶復合物(終濃度=1 μ g/mL)，于37°C反應30分鐘，使鏈霉親和素-堿 性磷酸酶復合物與結合在PCR產物5'端上的生物素相結合，用去離子水充分洗滌；（6)取 100XNBT 100 μ L加入到IOmL AP反應緩沖夜中，混勻后，再加入100XBCIP 100 μ 1，混勻， 即配成反應工作液，加入混合NBT/BCIP的顯色反應液顯色(一般約20~30min)，完成顯色 后用去離子水洗絳后甩干。
【主權項】
1?本發明涉及針對辣椒萎黃病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV)的檢驗檢疫 和分子生物學研宄或檢測方法，該方法通過逆轉錄PCR擴增以及DNA雜交技術檢測樣品中 CaCV基因，其特征在于：所進行的研宄或檢測方法涉及以下引物序列（自左至右按5'端到 3'端方向排列）： 上游引物序列：GGTGCAAGGCCTTTAATGCTGGA; 下游引物序列：GAG GAT TGG ACT ITT AAG AGA A。
2. 根據權利要求1所述的研宄或檢測方法，其特征在于：該研宄或檢測方法涉及以下 寡核苷酸探針序列（自左至右按5'端到3'端方向排列）： 寡核苷酸探針序列：ATGTGCTCTCAGGATGA。
3. 根據權利要求1、2所述的研宄或檢測方法，其特征在于：該研宄或檢測方法所涉及 的寡核苷酸探針序列的5'端有一個5~25mer的poly (dT)結構。
【專利摘要】本發明屬于一種基于DNA體外擴增技術的植物病毒分子生物學研究和檢測方法，涉及針對辣椒萎黃病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV）的檢驗檢疫和分子生物學研究。本發明以CaCV非結構蛋白（Nonstructural Protein）基因的Ph segment S序列為靶序列，通過序列分析排除二級結構和非特異性序列區間，最終篩選出所需要的引物和探針。本發明的目的就是提供一種適用性廣、特異性好、擴增效率高的引物和探針序列，以便對CaCV進行簡易快速的田間檢測或實驗室檢測。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-94
【公開號】CN104862427
【申請號】CN201510365563
【發明人】王利兵, 彭梓, 吳志鵬
【申請人】王利兵, 吳志鵬
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月29日