一種基于實時熒光定量pcr的快速檢測藏紅花真偽的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物技術領域，具體涉及一種基于實時熒光定量PCR的快速檢測 藏紅花真偽的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 藏紅花（Crocw1S saiiras)，是鸞尾科草本植物，其原生地在地中海沿岸至喜瑪拉 雅山麓，因此在中國被稱為藏紅花、番紅花或西紅花。藏紅花的主產地在希臘、西班牙和伊 朗等國，在中國只有少量栽培。由于其產量極低，采收耗時費力，在中國被列為珍稀名貴中 藥材。藏紅花具有很強的活血化瘀和散郁開結的功效，一直被用于臨床。尤其在蒙藥藏藥 的很多傳統方劑中，都以臧紅花為主藥，且多有良效。研宄發現，藏紅花具有良好的抗癌活 性，而且幾乎無毒副作用，所以再次引起了人們的重視。隨著現代醫學藥學和分子生物學等 領域的飛速發展，對藏紅花的藥用價值有了比較詳細的研宄，并逐步揭示了藏紅花素類物 質的藥理作用，特別是其抗癌活性和抗癌機理的研宄使得藏紅花素類物質很有可能成為未 來理想的抗癌藥物之一。
[0003] 正是由于其高昂的價格，一些不法商販制造假藏紅花出售，嚴重影響了用藥的安 全性。因此，需要建立一種快速可靠的方法，對市場上的藏紅花及藏紅花制品進行鑒定。因 此，本專利建立一種基于實時熒光定量PCR的快速檢測藏紅花真偽的方法及試劑盒。
[0004] 市場上常見的偽品有：菊科植物菊花（CAzy1Sa/? 、睡蓮科植 物睡蓮（AfeirWffiAo /wci/era)的干燥雄蕊染色制品、玉米（Zea 須、菊科植物紅花 (CkriAa皿5· 染色制品。MatK基因常用于鑒別不同的屬，由于番紅花屬都是稀 有中藥，而偽品均非番紅花屬植物，所以可以Matk基因作為鑒別真偽。
[0005] TaqMan PCR，以其快速、敏感、特異，正在逐漸成為快速鑒定物種、亞型、基因型的 優選方法。其不僅在擴增時采用了特異性引物，更采用了特異性探針，有效避免了其他方法 顯色的非特異性。使該方法的特異性遠遠高于其他方法，大大減少了非特異性擴增造成的 假陽性結果。全封閉反應的熒光RT-PCR技術是通過計算機記錄并分析PCR過程中產生的 熒光信號，實現了對PCR擴增過程實時監測，無需電泳檢測，徹底杜絕了 PCR產物的氣溶膠 污染和EB對環境的污染。MGB探針相比普通熒光探針，序列更短，特異性更強，更適合用于 進行分型的檢測。應用一步法RT-PCR和MGB熒光水解探針，用于快速鑒定物種、亞型、基因 型，其敏感度很高。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種基于實時熒光定量PCR的快速檢測藏紅花真偽的方 法。
[0007] 本發明的另一目的在于提供一種基于實時熒光定量PCR的快速檢測藏紅花真偽 的試劑盒。
[0008] 本發明所采取的技術方案是： 一種實時熒光定量PCR快速檢測藏紅花的PCR引物，其序列為： CS-F :5' - CCGTATCGGGACATCCTATTAGTAA -3'（SEQ ID NO. 1)， CS-R:5' - GACCAAATCGCTCAATAATACTAGAATC -3' （SEQ ID N0.2)。
[0009] -種實時熒光定量PCR快速檢測藏紅花的試劑盒，該試劑盒含有上述所述的引 物。
[0010] 進一步的，上述試劑盒還含有實時熒光定量PCR檢測探針，其序列為： CS-P :5' - CCCATCTGGACCGATT -3' （SEQ ID N0.3)。
[0011] 進一步的，上述試劑盒還含有植物內參基因 tRNA-Leu的引物和探針，其序列為： 引物： trnL-F:5' - CGAAATCGGTAGACGCTACG -3'（SEQ ID N0.4)， trnL-R:5' - TTCCATTGAGTCTCTGCACCT -3' （SEQ ID N0.5)， 探針： trnL-P :5' -Fam- GCAATCCTGAGCCAAATCC -3' BHQl (SEQ ID N0.6)。
[0012] 一種基于實時熒光定量PCR的快速檢測藏紅花真偽的方法，包括以下操作步驟： 1) 待測樣品的DNA提取； 2) 熒光定量PCR擴增： 反應體系：每25 μ 1反應體系中含有：PCR Mix 20 μ I、Taq酶?μL，待檢測的DNA 4μ1 ; 其中每50mL PCR Mix的配方如下：
【主權項】
1. 一種實時熒光定量PCR快速檢測藏紅花的PCR引物，其序列為： CS-F :5' - CCGTATCGGGACATCCTATTAGTAA -3'（SEQ ID NO. 1)， CS-R:5' - GACCAAATCGCTCAATAATACTAGAATC -3' （SEQ ID N0.2)。
2. -種實時熒光定量PCR快速檢測藏紅花的試劑盒，其特征在于：該試劑盒含有權利 要求1所述的引物。
3. 根據權利要求2所述的一種實時熒光定量PCR快速檢測藏紅花的試劑盒，其特征在 于：該試劑盒還含有實時熒光定量PCR檢測探針，其序列為： CS-P :5' - CCCATCTGGACCGATT -3' （SEQ ID N0.3)。
4. 根據權利要求2所述的一種實時熒光定量PCR快速檢測藏紅花的試劑盒，其特征在 于：該試劑盒還含有植物內參基因 tRNA-Leu的引物和探針，其序列為： 引物： trnL-F:5' - CGAAATCGGTAGACGCTACG -3'（SEQ ID N0.4)， trnL-R:5' - TTCCATTGAGTCTCTGCACCT -3' （SEQ ID N0.5)， 探針： trnL-P :5' - GCAATCCTGAGCCAAATCC -3' （SEQ ID N0.6)。
5. -種基于實時熒光定量PCR的快速檢測藏紅花真偽的方法，其特征在于：包括以下 操作步驟： 1) 待測樣品的DNA提取； 2) 熒光定量PCR擴增： 反應體系：每25 μ 1反應體系中含有：PCR Mix 20 μ I、Taq酶?μL，待檢測的DNA 4μ1 ; 其中每50mL PCR Mix的配方如下：
當對內參基因 tRNA-Leu進行PCR擴增時，將PCR Mix中的CS-F、CS-R、CS-P改用為 trnL-F、trnL-R和trnL-P，PCR Mix中其他成分及用量均不變； 反應體系條件：ABI PRISM 7300/7500等儀器循環條件為94°C 2分鐘，94°C 15秒， 55 °C 30秒，40個循環； 3) 結果分析： 陽性：檢測樣本Ct值小于等于35. 0,且曲線有明顯的指數增長期； 可疑：檢測樣本Ct值大于35. 0且小于40. 0,重復一次實驗，如果Ct值仍小于40. 0,且 曲線有明顯的指數增長期，為陽性，否則為陰性； 陰性：檢測不到樣本Ct值或Ct值為40 ; 4) 樣品中是否參假的鑒別： 取真品藏紅花樣本，用上述相同的方法分別擴增相應的目的基因和內參tRNA-Leu基 因，計算出目的基因的相對濃度，若待測樣本中目的基因的相對濃度低于真品藏紅花的濃 度，則判定為存在參假；否則判定為不存在參假。
【專利摘要】本發明公開了一種基于實時熒光定量PCR的快速檢測藏紅花真偽的方法及試劑盒，本發明的檢測方法及試劑盒操作簡便快速，特異性高，檢測效果敏感、可靠，最低檢測濃度可達1×101拷貝/μl。能夠實現對市場上的藏紅花及藏紅花制品進行快速檢測，應用極為方便。由于引入了特異性擴增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，同時大大提升了批量檢測的效率，從而避免了其他檢測方法特異性不高、或無法短時間內判定藏紅花真偽的缺點。基于上述優點，該試劑盒適合在各級藥品監督管理部門進行推廣應用，具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104862390
【申請號】CN201510224531
【發明人】張曉瑋, 徐貴峰, 鄧武, 徐貴云
【申請人】廣州維伯鑫生物科技有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月5日