人肝癌細胞HepG2電轉染的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程領域,尤其涉及一種人肝癌細胞H印G2電轉染的方法。
【背景技術】
[0002]HepG2細胞即人肝腫瘤細胞株,該細胞分泌多種血漿蛋白:清蛋白、α 2_巨球蛋白、血纖維蛋白溶酶原、鐵傳遞蛋白等。該細胞能大容量培養,乙肝表面抗原陰性,對G418有抗性,對人生長激素有刺激反應,多應用于遺傳毒理學及病毒培養等方面的研宄。
[0003]HepG2細胞常采用脂質體轉染方法,操作周期一般為兩天,但是,脂質體試劑需單獨購買,價格昂貴,且帶有毒性,會影響細胞的正常生長。病毒轉染是HepG2細胞的另一種常用的轉染方法,但其購買途徑復雜,價格昂貴,操作繁瑣,制備周期長,并且改造后的病毒仍然具有侵染性,對細胞影響較大。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種成本低廉、操作簡便快捷、轉染穩定且效率高的人肝癌細胞IfepG2電轉染的方法。
[0005]為解決上述技術問題,本發明采用以下技術方案:人肝癌細胞H印G2電轉染的方法,采用等滲透壓的電轉染緩沖液,對人肝癌細胞HepG2進行一次放電;電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg,一次放電的電壓為130?810V,持續時間為45?75 μ s (微秒)。
[0006]一次放電的電壓為300?400V或400?600V或600?700V或700?800V。
[0007]一次放電的電壓為390V或520V或650V或780V,持續時間為75 μ S。
[0008]電轉染緩沖液為等滲透壓溶液,等滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO40.3mM、K2HPO40.85mM、肌醇 280m0smol/kg,ρΗ7.I ?7.3,電導率,25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
[0009]電轉染是一種較受歡迎的細胞轉染方法,其只需要普通緩沖鹽溶液,成本低廉,操作簡便,通常只需一天,并且對細胞的毒副作用較小。針對脂質體轉染和病毒轉染操作復雜、周期長且毒性大等問題,發明人結合電轉染的上述優點,建立了一種人肝癌細胞IfepG2電轉染的方法,該法主要采用等滲透壓的電轉染緩沖液,對人肝癌細胞H印G2進行一次放電,通過脈沖電場和脈沖磁場交替作用及與等滲透壓組合,使細胞膜透性增加,膜強度減弱,使得外源分子更容易進入細胞質中,從而提高轉染效率。實際測試表明,應用本發明HepG2細胞轉染pmaxGFP(綠色熒光蛋白)細胞學實驗轉染效率達到45%左右。同時,本發明可以減少試劑購買及運輸的過程,縮短實驗操作時間,降低了研宄成本,為人肝癌細胞HepG2后續研宄提供了簡便的細胞轉染方式。
【附圖說明】
[0010]圖1是傳統脂質體轉染HepG2細胞的熒光顯微鏡圖。
[0011]圖2是傳統脂質體轉染HepG2細胞不加質粒的陰性對照的熒光顯微鏡圖。
[0012]圖3是本發明電轉染(390V)!fepG2細胞的熒光顯微鏡圖。
[0013]圖4是本發明電轉染(520V)!fepG2細胞的熒光顯微鏡圖。
[0014]圖5是本發明電轉染(650V)!fepG2細胞的熒光顯微鏡圖。
[0015]圖6是本發明電轉染(780V)!fepG2細胞的熒光顯微鏡圖。
[0016]圖7是各種不同條件下轉染進gfp的細胞占總細胞的比例的柱狀圖。
【具體實施方式】
[0017]采用脂質體轉染和本發明電轉染方法的轉染效率進行對比,同時設置不轉染質粒的組作為陰性對照。
[0018]—、人肝癌細胞H印G2電轉染的方法
[0019]試驗方法:用人肝癌細胞H印G2通過本發明電轉染方法轉染AMAXA公司的貨號為VPA1001的pmaxGFP(綠色熒光蛋白)質粒,采用熒光顯微鏡拍照計算發綠色熒光數目的細胞以分析轉染效率。試驗中包括了對細胞實施四種不同電壓,相同滲透壓的緩沖液以及相同脈沖時長的放電時間。
[0020]試驗設備:型號eppendorf multiporator,貨號 4308CG831520。
[0021]電轉染方法:采用等滲透壓的電轉染緩沖液,對人肝癌細胞H印G2進行一次放電;電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg,一次放電的電壓分別為390V、520V、650V、780V,持續時間為75 μ s。等滲透壓溶液配方為KCl,25mM ;KH2PO4,0.3mM ;K2HP040.85mM ;肌醇280m0smol/kg,pH7.1 ?7.3,電導率,25 度 3.2 ?3.8mS/cm)。
[0022]具體試驗步驟如下:
[0023]指數時期收集細胞,以滲透壓為280m0smol/kg的等滲緩沖液稀釋細胞,并加入質粒,要求細胞終密度為2xl06cells/ml,質粒終濃度為20 μ g/ml ;分裝400 μ I至直徑為2mm的電轉杯后,施加電壓;
[0024]第一次條件為:電壓390V,滲透壓280m0smol/kg,持續時間75 μ s ;
[0025]第二次條件為:電壓520V,滲透壓280m0smol/kg,持續時間75 μ s ;
[0026]第三次條件為:電壓650V,滲透壓280m0smol/kg,持續時間75 μ s ;
[0027]第四次條件為:電壓780V,滲透壓280m0smol/kg,持續時間75 μ S。
[0028]二、人肝癌細胞HepG2脂質體轉染方法
[0029]將I μ g的質粒和I μ I的脂質體分別加入50 μ I的optin_DMEM培養基中,靜置5min ;混合均勻后靜置20min,然后加入到孔板中;用400 μ I的optin_DMEM培養基補足剩余的培養基;6h后對細胞進行換液。
[0030]三、實驗數據及結果
[0031]如圖1至7所示,傳統脂質體轉染效率在8%左右,而采用本發明方法隨著電壓的增高,人肝癌細胞H印G2的轉染效率呈梯度增高趨勢,390V時達到6%左右,520V時達到23%左右,650V時達到32%左右,780V時達到45%左右。
[0032]通過對比數據可知,本發明通過高場強電脈沖和等滲透壓組合的方式,對細胞施加不同電壓后,外源分子進入細胞質的數量呈遞增趨勢,在390V的條件下,!fepG2細胞轉染pmax(綠色熒光蛋白)細胞學實驗結果的轉染效率和脂質體轉染接近,400?800V轉染效率都高于脂質體轉染,并且該轉染方法操作簡便、節約成本、周期較短,可為以后以H印G2細胞為模型進行的細胞轉染實驗提供有效的方法。
【主權項】
1.一種人肝癌細胞IfepG2電轉染的方法,其特征在于采用等滲透壓的電轉染緩沖液,對人肝癌細胞HepG2進行一次放電;所述電轉染緩沖液的滲透壓為280m0smol/kg,一次放電的電壓為130?810V,持續時間為45?75 μ S。
2.根據權利要求1所述的人肝癌細胞IfepG2電轉染的方法,其特征在于:所述一次放電的電壓為300?400V或400?600V或600?700V或700?800V。
3.根據權利要求2所述的人肝癌細胞!fepG2電轉染的方法,其特征在于:所述一次放電的電壓為390V或520V或650V或780V,持續時間為75 μ S。
4.根據權利要求3所述的人肝癌細胞!fepG2電轉染的方法,其特征在于:所述電轉染緩沖液為等滲透壓溶液,等滲透壓溶液組成為KCl 25mM、KH2PO4 0.3mM、K2HPO4 0.85mM、肌醇 280m0smol/kg,pH7.1 ?7.3,電導率,25 度 3.2 ?3.8mS/cm。
【專利摘要】本發明公開了一種人肝癌細胞HepG2電轉染的方法,該法主要采用等滲透壓的電轉染緩沖液,對人肝癌細胞HepG2進行一次放電,通過脈沖電場和脈沖磁場交替作用及與等滲透壓組合,使細胞膜透性增加,膜強度減弱,使得外源分子更容易進入細胞質中,從而提高轉染效率。實際測試表明,應用本發明HepG2細胞轉染pmaxGFP(綠色熒光蛋白)細胞學實驗轉染效率達到45%左右。同時,本發明可以減少試劑購買及運輸的過程,縮短實驗操作時間,降低了研究成本,為人肝癌細胞HepG2后續研究提供了簡便的細胞轉染方式。
【IPC分類】C12N15-87
【公開號】CN104862338
【申請號】CN201510278986
【發明人】周磊, 梁明振, 康會芳, 李一星
【申請人】廣西大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月27日