水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK15在提高種子活力上的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于促分裂原活化蛋白激酶及其編碼基因與應用技術領域，具體涉及水稻 促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75在提高種子活力上的應用。
【背景技術】
[0002] 自然界的植物是一個有固著的多細胞有機體，它不能像動物一樣通過移動來擺脫 不利的環境條件。因此自然界的植物面臨各種各樣的生存壓力，如干旱、高鹽以及溫度變化 等等，而外界環境的不斷變化會對植物的生長發育產生一定的影響。MPK家族在植物的脅 迫應答中介導了非常復雜的信號通路，使植物在面對變化莫測的環境條件時，及時地做出 調節，以便更好的適應環境的改變。
[0003] 當植物暴露于高濃度鹽的土壤中時，就會發生鹽脅迫，它會對植物的的生長和發 育產生嚴重的影響，特別是一些農業作物的產量。鹽脅迫對植物產生的毒害主要有兩個方 面的原因：一是土壤中高濃度的鹽使得植物根對水的吸收變得困難；二是植物中高濃度的 鹽會導致植物中毒。世界上的植物，除了少數耐鹽植物外，大多數植物都不能忍受高鹽的脅 迫。植物應對鹽脅迫主要是通過鹽分過于敏感I (salinity overly sensitive I，S0S1) Na+/H+逆向轉運蛋白、HKT轉運蛋白和液泡膜上的NHXl逆向轉運蛋白，來降低細胞內Na+的 濃度。在高鹽和高滲的早期會觸發細胞內一系列的信號通路，包括ROS的形成，誘導由PLD 介導的憐脂酸的廣生，細胞質內Ca2+濃度瞬時升尚和NO的積累。尚鹽和尚滲可以激發許多 MAPK家族的成員。在擬南芥中，高鹽和高滲可以快速的激活MKKK20,而MKKK20處于MPK6 的上游，它可以激活MPK6。在高鹽高滲早期MPK6可以迅速的磷酸化SOSl Na+/H+逆向轉運 蛋白，降低細胞內的Na+。此外，就長期來說，MPK6還可以通過磷酸化鋅指轉錄因子ZAT6來 調節高鹽誘導的應答基因的表達。在擬南芥中存在MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4的MPK信號通 路，突變體表現了對鹽的耐受性，因此相對MKKK20對鹽脅迫的正調控而言，MEKKl可 能是鹽脅迫的一個負調控因子。此外，擬南芥的MKK9和MPK3,苜蓿的SMK，煙草的SIPK，玉 米的ZmMPK3、ZmMAPK5和ZmSMKl以及棉花的GhMPK7等均參與了鹽脅迫的應答。
[0004] 在水稻中，17個MPK家族成員根據特征基序和序列的特征，可以分別劃分為TDY、 TEY兩大類和7大組，其中A組包含了 OsMAPKI和0sMAPK5 ;B組包括了 0sMAPK2和0sMAPK2 ; C 組包括了 0sMAPK3 和 OsMAPM ;D 組成員有 0sMAPK7、0sMAPK8、0sMAPK9 和 OsMAPKIO ;E 組 包括了 0sMAPK13、0sMAPK14、0sMAPK15 和 0sMAPK16 ;F 組只有 0sMAPK17。
[0005] 已有的報道表達表明，水稻MAPK在植物各個組織器官中均有表達。已有的報道表 明，絕大部分的MPK都參與了水稻的非生物脅迫應答，包括干旱、高鹽、低溫/高溫、氧化應 激以及重金屬脅迫等。如，水稻0sMAPK5，它是水稻比較特殊的MPK基因，它參與了幾乎所 有的非生物脅迫應答反應，包括干旱、高鹽、臭氧、UV-C射線、重金屬和溫度變化等。此外， 水稻的 0sMKKl-0sMPK4、0sMPK3、0sMKK4-0sMPK6 以及 0sMKKl、4、6 和 10-2 等都參與 了水稻 的脅迫應答過程。
[0006] 水稻是世界上重要的糧食作物，而種子是農業生產的根本。種子的活力對于植物 繁殖、作物產量、種質資源保存和生物多樣性起著決定性的影響。在逆境條件下，高質量的 種子仍能夠保持高的萌發率和長出健壯的幼苗。但是，在萌發時對逆境變得越來越敏感，最 終不能萌發。
[0007] 鑒于以上所述，本發明成功克隆了水稻基因的全長，通過構建水稻 的過表達載體，轉化模式植物擬南芥，結果表明轉基因擬南芥種子比野生型擬南芥 種子具有更強的在氯化鈉脅迫下的萌發活力。可以用于植物的遺傳轉化，提高植物 種子的萌發活力。對于水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75的功能尚未見相關報道。
【發明內容】
[0008] 本發明解決的技術問題是提供了一種水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 在提高種子活力上的應用。
[0009] 本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案，水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 在提高種子活力上的應用，其特征在于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 的核苷序列如SEQ ID N0:1所示，大小為1497bp。
[0010] 進一步限定，所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75應用于提高植物種 子在鹽脅迫下的萌發活力，所述的植物為擬南芥、水稻、玉米、大豆或小麥。
[0011] 本發明所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高種子活力上的應用，其特征在 于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，大小為498aa。
[0012] 進一步限定，所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶應用于提高植物種子在鹽脅迫下 的萌發活力，所述的植物為擬南芥、水稻、玉米、大豆或小麥。
[0013] 本發明所述的提高植物種子鹽脅迫下萌發活力的植物表達載體，其特性在于：所 述的植物表達載體轉入了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA。
[0014] 進一步限定，所述的植物表達載體的具體構建方法是利用水稻促分裂原活化蛋白 激酶基因你#/%75的CDNA插到植物表達載體pCAMBIA-1302上的啟動子下游，構 建成在基因基因的cDNA上游含有啟動子的新的植物表達載體，命名為 pCAMBIA-1302-0sMPK15。通過花序侵染法轉化模式植物擬南芥，成功獲得轉基因植株，繼續 培養直到獲得T3代的轉基因純合子，將轉基因純合子種子和野生型種子在含有150mM的氯 化鈉的MS固體培養基上萌發，結果顯示轉基因種子的萌發速度和最終萌發率都明顯高于 對照的野生型種子，表明水稻促分裂原活化蛋白激酶基因夠有效提高植物種子 在鹽脅迫下的萌發活力。
[0015] 本發明所述的攜帶有水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的植物表達載體 pCAMBIA-1302-0sMPK15能夠通過使用Ti質粒、Ri質粒或植物病毒載體直接DNA轉化、微注 射或電穿孔導入到植物細胞。
[0016] 本發明的有益效果為：從水稻中分離到的促分裂原活化蛋白激酶基因 通過轉化模式植物擬南芥證實了能夠有效提高植物種子在鹽脅迫下的萌發活力；將水稻促 分裂原活化蛋白激酶基因你#/%7辟專入到水稻、玉米、大豆或小麥等重要農作物中，能夠提 高重要農作物種子在鹽脅迫下的活力，其應用可降低全球每年因鹽脅迫而造成的巨大農業 損失，具有重要的經濟效益和應用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發明含水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的植物表達載體的構建 模型，圖2是鹽脅迫下轉基因擬南芥與野生型擬南芥的表型對比圖，其中A為150mM NaCl、 B 為 200mM NaCl、C 為 300mM NaCl。
【具體實施方式】
[0018] 以下通過實施例對本發明的上述內容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本 發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容實現的技術均屬于本發 明的范圍。
[0019] 實施例1水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 cDNA編碼區的獲得 (1)水稻的種植 取日本晴水稻（A L. spp. cv Nipponbare, AA genome)種子若干置 于小燒杯中，用體積分數為75%的酒精消毒30sec，再用無菌水沖洗5-6次，每次沖洗lmin。 用無菌水完全淹沒種子，浸泡lh。將種子轉移至培養皿中，加入適量的水(不能完全淹沒種 子)，28°C黑暗培養2-3d。待種子長出幼芽后，采用人工氣候箱進行培養，培養條件為28°C、 光照強度160001x、光照時間為16h/d。
[0020] (2)水稻總RNA的提取和cDNA的制備 TRIzol 方法提取培養的水稻根總 RNA，按照 8 μ L RNA+1 μ L buffer+Ι μ L RNase-free DNaseI (TaKaRa)的體系，等比例擴大消化24 μ L的RNA，37°C處理30min。65°C溫浴IOmin 終止消化反應后，以OligodT和Random 6 mers 為引物，利用 PrimeScript? RT Enzyme Mix I 37°C溫浴15min，之后85°C 5sec終止反應，合成cDNA第一鏈。
[0021] (3)水稻因 cDNA編碼區的擴增 設計引物從上述制備的水稻根組織的cDNA為模板，克隆因的cDNA編碼區。 所用反應體系如下：
【主權項】
1. 水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75在提高種子活力上的應用，其特征在于： 所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75的核苷序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 根據權利要求1所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因在提高種子活力上 的應用，其特征在于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因應用于提高植物種 子在鹽脅迫下的萌發活力。
3. 根據權利要求2所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因在提高種子活力上 的應用，其特征在于：所述的植物為擬南芥、水稻、玉米、大豆或小麥。
4. 水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高種子活力上的應用，其特征在于：所述的水稻促 分裂原活化蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
5. 根據權利要求4所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高種子活力上的應用，其特 征在于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶應用于提高植物種子在鹽脅迫下的萌發活力。
6. 根據權利要求5所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高種子活力上的應用，其特 征在于：所述的植物為擬南芥、水稻、玉米、大豆或小麥。
7. -種提高植物種子鹽脅迫下萌發活力的植物表達載體，其特性在于：所述的植物表 達載體轉入了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA。
8. -種權利要求7所述的提高植物種子鹽脅迫下萌發活力的植物表達載體的構建方 法，其特性在于：利用水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA插到植物表達載 體pCAMBIA-1302上的啟動子下游，構建成在基因基因的cDNA上游含有 啟動子的新的植物表達載體。
9. 權利要求7所述的提高植物種子鹽脅迫下萌發活力的植物表達載體能夠通過使用 Ti質粒、Ri質粒或植物病毒載體直接DNA轉化、微注射或電穿孔導入到植物細胞。
【專利摘要】本發明公開了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK15在提高種子活力上的應用，屬于促分裂原活化蛋白激酶及其編碼基因與應用技術領域。本發明的技術方案要點是通過PCR方法擴增出水稻OsMPK15基因的全長編碼區cDNA，構建OsMPK15的過表達載體，提高OsMPK15基因的表達，轉化模式植物擬南芥，結果表明在轉基因的T3代植株中，轉基因擬南芥種子比野生型擬南芥種子具有更強的在氯化鈉脅迫下的萌發活力。因此，如果將OsMPK15轉入到水稻、玉米、大豆和小麥等重要農作物中，則可能提高重要農作物種子在鹽脅迫下的活力。OsMPK15的應用可降低全球每年因鹽脅迫而造成的巨大農業損失，具有重要的經濟效益和應用前景。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-54, C12N15-82
【公開號】CN104862325
【申請號】CN201510288858
【發明人】梁衛紅, 黃俊駿, 楊丹丹, 張靜, 石佳, 閆鑫甜, 王高華
【申請人】河南師范大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月1日