Pg-rca檢測ev71的引物組及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及檢測腸道病毒71型（EV71)的引物組及檢測方法，特別涉及PG-RCA檢 測EV71的引物組及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 腸道病毒71型（enterovirus71，EV71)是小RNA病毒科、腸道病毒屬成員，是引 起嬰幼兒手足口病（hand-foot-mouthdisease，HFMD)的主要病原體，對中樞神經系統有極 高的感染性，重癥患者比例明顯高于其他腸道病毒，在世界范圍內已引起10余次的爆發和 流行。
[0003] 常規的EV71診斷技術包括免疫學方法、病毒分離培養、PCR方法等，但大多存在難 以早期診斷或敏感性或特異性低等缺陷。
[0004] 腸道病毒的傳統檢測方法為先將病毒分離培養，然后進行血清中和試驗定型分 類，此法繁瑣、耗時、費力，雖然多數培養結果可在1周內得到，但中和試驗卻十分費時、昂 貴，甚至有時無法定型。
[0005] PCR方法具有快速、敏感性強、特異性高等諸多優點，已應用于腸道病毒的檢測，但 常規檢測EV71RNA的RT-PCR方法需要精密的實時熒光PCR儀，對操作分析人員技術要求 較高，且需逆轉錄及PCR兩個實驗才能完成檢測，因而使其不適用于現場快速檢測及基層 普及應用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種PG-RCA檢測EV71的引物組及檢測方法，適用于現場快 速檢測及基層普及應用，能夠快速、高效的檢測EV71。
[0007] 為實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種PG-RCA檢測EV71的引物 組，包括：
[0008] 引物模板T:
[0009] TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCTTTTT；
[0010] 引物P:GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG;以及
[0011] 環狀探針CP前體：
[0012] GCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATo
[0013] 相應地，本發明還提供了應用上述PG-RCA檢測EV71的引物組檢測EV71的方法， 包括以下步驟：
[0014] (1)提取待檢測樣品中的病毒RNA;
[0015] (2) 0. 5yL的所述病毒RNA、引物模板T、引物P、1XVent(exo_)DNA聚合酶緩沖液 補足5yL，80°C變性3min，37°C退火；
[0016] (3)然后加入5yL的PG-RCA反應體系，60°C恒溫擴增，監測反應熒光強度2~3小 時，得出檢測結果，其中，PG-RCA反應體系包含：dNTP、環狀探針CP、0. 05UVent(ex〇-)DNA 聚合酶、1UNb.BsmI(切割酶的一種）、SYBRGreenI(染料）、lXVent(ex〇-)DNA聚合酶緩 沖液補足5yL。
[0017] 在一些實施方式中，在步驟（2)中，變性反應前，引物模板T和引物P的終濃度為 lnM〇
[0018] 在一些實施方式中，在步驟（3)中，dNTP終濃度為0. 8mM，環狀探針CP終濃度為 15nM。
[0019] 本發明的有益效果為：本發明的引物模板T、引物P以及環狀探針CP根據EV71 VP1基因區保守序列設計，建立了三向連接構造（Three-wayjunctionformation，3WJ) 組合引物介導的滾環擴增技術（Primergeneration-rollingcircleamplification， PG-RCA)技術用于檢測EV71的方法，能檢測到amol(10_18mol)級的EV71合成RNA，檢測臨 床標本時特異性強、敏感度好。
[0020] 本發明的檢測方法具備如下優點：
[0021] 1、PG-RCA反應前一次加完所有試劑，操作簡單步驟少；
[0022] 2、本檢測方法只需一個恒溫設備和一個信號收集設備，在實驗中僅利用了實時熒 光PCR儀的恒溫及收集熒光的功能，使檢測操作簡單；
[0023] 3、本檢測方法在檢測過程中不需打開試管蓋，擴增的單鏈引物片段易降解，在很 大程度上降低PCR過程中的污染概率。
[0024] 因此，本檢測方法操作簡單、快速、高效，適合各個層面的衛生醫療單位普及應用。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發明的實施例1中15%聚丙烯酰胺凝膠電泳成像；
[0026] 圖2為本發明的實施例2中PG-RCA檢測EV71的方法的靈敏度測試結果圖；
[0027] 圖3為本發明的實施例2中PG-RCA檢測EV71的原理圖；
[0028] 圖4為本發明的實施例3中PG-RCA檢測EV71的方法檢測臨床樣本的結果圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。
[0030] 實施例1
[0031] (1)引物模板、引物及探針的設計。
[0032]在NCBI((NationalCenterforBiotechnologyInformation，是指美國國立生 物技術信息中心）搜索20個EV71VP1基因序列。對上述20條序列進行比對，在其保守區 選取50堿基的保守序列作為靶序列，命名為RNA71，同時根據RNA71序列PrimerPremier 5軟件設計引物模板T、引物P以及環狀探針CP前體。RNA71、引物模板T、引物P序列見表 1〇
[0033] 表 1
[0034]
【主權項】
1. PG-RCA檢測EV71的引物組，其特征在于，包括： 引物模板T : TGCTCAAGGTGTGTGAATGCTTTTTCATAATCTGAGGGCTCTGCTCACGCTATCTTTTT ； 引物 P:GGTGCTGGTAGAGCGTGAGGATTATG;以及 環狀探針CP : GCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATGCTGTGCTCAAGGTGTGTGAATo
2. 應用權利要求1所述PG-RCA檢測EV71的引物組檢測EV71的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 提取待檢測樣品中的病毒RNA ; (2) 0. 5 y L的所述病毒RNA、引物模板T、引物P、I X Vent (exo-) DNA聚合酶緩沖液補足 5yL，80°C變性 3min，37°C退火； (3)然后加入5yL的PG-RCA反應體系，60°C恒溫擴增，監測反應熒光強度2~3小時， 得出檢測結果，其中，PG-RCA反應體系包含：dNTP、環狀探針CP、0. 05UVent(ex〇-)DNA聚合 酶、IUNb.BsmI、SYBRGreenI、IXVent(exo_)DNA聚合酶緩沖液補足5yL0
3. 根據權利要求2所述的PG-RCA檢測EV71的引物組檢測EV71的方法，其特征在于， 在步驟（2)中，變性反應前，所述引物模板T和引物P的終濃度為InM。
4. 根據權利要求2所述的PG-RCA檢測EV71的引物組檢測EV71的方法，其特征在于， 在步驟（3)中，所述dNTP終濃度為0. 8mM，所述環狀探針CP終濃度為15nM。
【專利摘要】本發明公開了一種PG-RCA檢測EV71的引物組及檢測方法。引物模板T、引物P以及環狀探針CP根據EV71VP1基因區保守序列設計，建立了3WJ組合PG-RCA技術用于檢測EV71的方法，能檢測到amol(10-18mol)級的EV71合成RNA，檢測臨床標本時特異性強、敏感度好。檢測方法操作簡單、快速、高效，適合各個層面的衛生醫療單位普及應用。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104846123
【申請號】CN201510247029
【發明人】張宏萍, 陸仁飛
【申請人】張宏萍
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月14日