基于檢測外周血線粒體dna氧化損傷評價體內氧化應激的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子診斷技術領域。具體地說，本發明提供了檢測外周血線粒體DNA 氧化損傷的試劑在制備評價體內氧化應激的試劑中的應用，以及基于檢測外周血線粒體 DNA氧化損傷評價體內氧化應激的方法。
【背景技術】
[0002]氧化應激，指機體活性氧（reactive oxygen species，R0S)或活性氮（reactive nitrogen species，RNS)產生過多和/或機體抗氧化能力減弱，R0S或RNS清除不足，導致 體內R0S或RNS增多，破壞了機體的氧化/還原的正常失衡，從而導致組織和細胞發生氧化 損傷的病理過程。因此，評價體內氧化應激在疾病診斷和相關科學研宄中（如氧化應激與 衰老、神經退行性變、代謝性疾病等的相關研宄）均有重要意義。
[0003] 目前，對于氧化應激水平的評價體系主要包括檢測以下生物分子：1)活性氧/ 活性氮修飾的生物分子：包括蛋白質氧化損傷標志物，如蛋白質羰基化、硝基化損傷、晚 期氧化蛋白產物（A0PP);脂質過氧化產物，如4-羥基壬烯醛（HNE)和丙二醛（MDA)，以 及核酸氧化損傷時產生的8_0HdG;2)抗氧化酶活性，如超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶（catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷脫甘肽 S 轉移酶酶（glutathione S-transferase，GST)和血紅素 氧化酶（heme oxygenase，H0)等。目前常用檢測方法主要包括，1)用分光光度法檢測MDA、 S0D、CAT、還原型/氧化型GSH、GPx等，方法簡單，且相對便宜，但穩定性差；2)利用ELISA 檢測MDA、HNE、8-OHdG等，該法比較可靠，費用相對較高。此外，利用高效液相色譜-電化學 (HPLC-ECD)法、氣質聯用（GC-MS)等可用于8-OHdG水平的檢測，但由于需要相關儀器，且操 作繁瑣、靈敏度低等缺點，難于推廣和應用。
【發明內容】
[0004] 在對外周血的分子診斷研宄中，認為外周血循環的核酸成分可成為反映疾 病狀態較好的指標。外周血包括血漿和血細胞（紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、單核細 胞、血小板等）。外周血中淋巴細胞的基因組DNA的氧化損傷，如8-羥基脫氧鳥苷 (8-hydroxydeoxygumlosine，8-〇HdG)/ 8_羥基鳥嗓呤（8-〇x〇-guanine，8_ox〇-G)的產 生或者DNA鏈的斷裂，已被應用于評價氧化應激狀態。與核基因組DNA相似，線粒體 DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)也存在類似的損傷。
[0005] mtDNA位于細胞線粒體內，為環狀雙鏈、多拷貝的DNA。人類完整的mtDNA為閉合 環狀雙鏈DNA，長16569bp，編碼37個基因。線粒體獨立存在于細胞核外的細胞器，是細胞 能量和R0S產生的主要場所。由于mtDNA暴露于高活性R0S環境中，且缺乏組蛋白保護和 有效的修復機制，mtDNA更易遭受氧化攻擊而產生氧化損傷，進一步導致DNA突變，其突變 率為核DNA的20倍。本專利基于mtDNA易氧化損傷的特點，通過分析細胞內、外mtDNA損 傷水平來更靈敏的反映氧化應激狀態，并將該方法應用于代謝綜合征患者和健康對照外周 血單個核細胞、血漿mtDNA氧化損傷水平的檢測。
[0006] 首先利用 8_ 氧化鳥嗓呤 DNA 糖基化酶（human oxoguanine glycosylase 1， hOGGl)在體外酶解DNA，該酶在體內為參與DNA堿基切除修復的關鍵酶，能特異性識別并切 除DNA雙鏈中8-OHdG，產生脫嘌呤（AP)位點，進而經堿基切除修復機制恢復正常G:C堿基 配對。在體外，hOGGl酶去除DNA分子上的8-OHdG后，通過設計引物，利用熒光定量PCR特 異性擴增mtDNA。由于mtDNA分子經hOGGl酶切后產生缺堿基位點，與未酶切的mtDNA存在 擴增的差異，結果上表現為Ct的差異，Ct差值（A Ct值）即反映mtDNA氧化損傷水平。
[0007] 在專利的效果評價中，利用不同濃度H202建立氧化應激細胞模型，用線粒體靶向 性抗氧化劑Mitoquinone (MitoQ)構建抗氧化細胞模型。H202作用細胞引起氧化應激是較為 常用的方法，本專利使用中低濃度（50-200 yM)H202。MitoQ是一種親脂性的帶正電荷的醌 醇類物質，可穿過細胞脂質雙分子層直接進入帶負電荷的線粒體，降低線粒體R0S的產生， 抑制線粒體膜電位的下降以及細胞色素C的釋放，具有線粒體保護作用
[0008] 一方面，本發明提供了檢測外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑在制備評價體內氧 化應激的試劑中的應用。
[0009] 進一步地，其中所述檢測外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑為PCR引物和人8-氧 化鳥嘌呤DNA糖基化酶（hOGGl)。
[0010] 再進一步地，其中PCR引物為選自下列引物對的引物對：
[0011]DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)；
[0012] C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)；
[0013]ND1：正向弓丨物 CCTAATGCTTACCGAACGAA (SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
[0014] 進一步地，選擇PCR引物：
[0015] DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)〇
[0016]另一方面，本發明提供了基于檢測外周血線粒體DNA氧化損傷來評價體內氧化應 激的非診斷方法，步驟包括：
[0017] (1)提取樣本 DNA;
[0018] (2)使用hOGGl處理部分DNA ;
[0019] (3)使用hOGGl處理過和未處理過的DNA進行qPCR反應；
[0020] (4)比較hOGGl處理過和未處理過的DNA的Ct值差異；
[0021] (5)根據Ct值差異，判斷8-羥基脫氧鳥苷（8-OH-dG)的含量，并間接反映DNA氧 化損傷和體內氧化應激的水平。
[0022] 進一步地，其中步驟（3)的qPCR反應中使用的引物選自下列引物對：
[0023]DLP1 :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)；
[0024]C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC(SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)；
[0025] ND1 ：正向弓丨物 CCTAATGCTTACCGAACGAA (SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
[0026] 再進一步地，其中步驟（3)的qPCR反應中使用的引物為：DLP1:正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID N0.1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTAITTA(SEQ ID N0.2)。
【附圖說明】
[0027] 圖1 :熒光顯微鏡觀察氧化應激和抗氧化應激細胞模型DCFH-DA熒光強度。
[0028] 圖2 :流式細胞儀監測R0S水平。
[0029] 圖3 :不同H202濃度下的細胞MDA含量和S0D活力。
[0030] 圖4 :氧化應激和抗氧化應激細胞模型CAT、GSH-S、S0D活力和MDA含量。
[0031] 圖5: ACt值計算圖示。
[0032] 圖6 :各對引物的擴增的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0033] 圖7 :qPCR擴增結果（DLP1引物為例，上為擴增曲線，下為溶解曲線）
[0034] 圖8 :各對引物擴增后的A Ct值。
[0035] 圖9 :利用DLP1檢測氧化應激和抗氧化細胞內和細胞上清mtDNA氧化損傷水平。
[0036] 圖10 :代謝綜合征患者和健康對照血清MDA含量比較。
[0037] 圖11 :外周血PBMC mtDNA與血漿游離mtDNA氧化損傷水平比較
【具體實施方式】
[0038] 實施例1引物設計
[0039] 根據NCBI基因庫人類mtDNA(NC_012920)標準序列，首先針對mtDNA D-loop區 (displacement loop)設計引物。D-loop區包含mtDNA重鏈合成的復制起始區，是mtDNA 復制的控制區，也是mtDNA與線粒體膜的結合位點，易受脂質過氧化物的影響，是mtDNA 突變的高發區，堿基突變率比其他區域高6-8倍。D-loop區包括三個高變區，高變區 I (npl6024-16383)、高變區II (np57-372)和高變區III (np438-574)。因此，為保證擴增的 特異性，在設計引物時避開這三個高變區。
[0040] 表1中顯示的DLP1引物擴增的片段，未涵蓋高變區，而DLP2引物擴增片段則部分 包含了高變區。此外，設計了擴增C0X1基因、C0X2基因和ND1基因的引物，以進行比較，這 些區域在mtDNA中相對保守且不易缺失。
[0041] 表1用于mtDNA氧化損傷檢測的引物列表
[0042]
【主權項】
1. 檢測外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑在制備評價體內氧化應激的試劑中的應用。
2. 權利要求1所述的應用，其中所述檢測外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑為PCR引 物和人8-氧化鳥嘌呤DNA糖基化酶（hOGGl)。
3. 權利要求2所述的應用，其中PCR引物為選自下列引物對的引物對： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)； C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)； NDl :正向引物 CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
4. 權利要求3所述的應用，其中PCR引物為： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)〇
5. 基于檢測外周血線粒體DNA氧化損傷來評價體內氧化應激的非診斷方法，步驟包 括： (1)提取樣本DNA ; ⑵使用hOGGl處理部分DNA ; (3) 使用hOGGl處理過和未處理過的DNA進行qPCR反應； (4) 比較hOGGl處理過和未處理過的DNA的Ct值差異； (5) 根據Ct值差異，判斷8-羥基脫氧鳥苷（8-OH-dG)的含量，并間接反映DNA氧化損 傷和體內氧化應激的水平。
6. 權利要求5所述的非診斷方法，其中步驟（3)的qPCR反應中使用的引物為選自下列 引物對的引物對： DLPl :正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA(SEQ ID NO. 2)； C0X2 :正向引物 ACGATCCCTCCCTTACCATC (SEQ ID NO. 7)，反向引物 TTGTCAACGTCAAGGAGTCG(SEQ ID NO. 8)； NDl :正向引物 CCTAATGCTTACCGAACGAA(SEQ ID NO. 9)，反向引物 GTAGATGTGGCGGGTTTTAG(SEQ ID N0.10)。
7. 權利要求6所述的非診斷方法，其中步驟（3)的qPCR反應中使用的引物為：DLP1 : 正向引物 ATATCCCGCACAAGAGTGCT(SEQ ID NO. 1)，反向引物 GGGAACGTGTGGGCTATTTA (SEQ ID NO. 2) 〇
【專利摘要】本發明提供了檢測外周血線粒體DNA氧化損傷的試劑在制備評價體內氧化應激的試劑中的應用，以及基于檢測外周血線粒體DNA氧化損傷評價體內氧化應激的方法。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104846075
【申請號】CN201510145466
【發明人】葉薇, 劉楚, 湯曉君, 呂建新
【申請人】溫州醫科大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年3月31日