一種鰒發光桿菌熒光素酶、編碼該酶的基因及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鰒發光桿菌熒光素酶、編碼該酶的基因及其應用，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 發光細菌是是一類在正常條件下能夠發射可見光的非致病性細菌。其發光機理屬 在熒光素酶和氧化還原酶共同參與下的酶促氧化反應。FMN-NADH氧化還原酶對NADH具有 特異性，在NADH存在的條件下，將FMN還原為FMNH 2，為發光酶促反應提供底物，熒光素酶催 化FMNH2&八碳以上長鏈脂肪醛（RCHO)發生氧化還原反應，同時釋放最大發光強度在波長 450_490nm的藍綠光。
[0003] 細菌熒光素酶：FMN_NADH氧化還原酶體外發光雙酶體系的發光強度與其必需底 物NADH的濃度在一定范圍內呈正相關關系。NADH廣泛存在于一切微生物體內，在特定代 謝時期的微生物細胞中NADH含量相對穩定，且不同活細菌胞內NADH含量基本一致；而細菌 死亡后，在胞內酶作用下，NADH將很快被分解。因此NADH可以作為具有代謝活性細胞的指 示物。目前利用鰒發光桿菌初步純化的熒光素酶_FMN:NADH氧化還原酶體外發光體系檢測 NADH，發光強度在1 X X l(T8m〇l/L之間具有較好的線性關系，且NADH最低檢測濃度 可達到IX lOAiol/L。基于發光細菌雙酶體系對NADH有較高的靈敏度和專一性，使得發光 細菌雙酶體系用于微生物檢測成為可能。但是目前利用鰒發光桿菌雙酶體系用于NADH進 行檢測，也存在著酶液制備量少，成本較高的缺陷。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種鰒發光桿菌熒光素酶基因，該基因可在大腸桿菌中實現高效的表 達并用于NADH的定量檢測，為代替發光細菌雙酶體系的檢測提供可能。
[0005] 一種鰒發光桿菌熒光素酶基因，其具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0006] 含有所述基因的重組表達載體。
[0007] 含有所述重組表達載體的微生物。
[0008] 一種鰒發光桿菌熒光素酶，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0009] 所述鰒發光桿菌熒光素酶在NADH的定量檢測方面的應用。
[0010] 一種所述鰒發光桿菌熒光素酶基因進行NADH定量檢測的方法，該方法包括如下 步驟：
[0011] (1)采用分子克隆技術將所述基因導入到大腸桿菌R〇settaDE3中，誘導表達熒光 素酶；
[0012] (2)驗證FMN :NADH氧化還原酶存在于大腸桿菌RosettaDE3中；
[0013] (3)重組大腸桿菌粗酶液制備：提取重組大腸桿菌RosettaDE3胞內產物，得到粗 酶制劑，采用該粗酶制劑進行NADH的定量檢測；該粗酶制劑中含有熒光素酶和FMN :NADH 氧化還原酶。NADH的定量檢測包括NADH標準液配制和對樣品進行發光檢測。NADH標準液 配制，繪制NADH濃度與熒光素酶和FMN :NADH氧化還原酶雙酶體系發光強度的標準曲線。 對樣品進行發光檢測。進一步的，所述的發光檢測是在微弱發光儀中于450-490nm下測量 體系的發光值，最佳為474nm。
[0014] 本發明通過導入鰒發光桿菌熒光素酶基因LuxAB，優化條件使外源熒光素酶蛋白 在大腸桿菌中實現高效的表達，并借助大腸桿菌R〇settaDE3本身含有高活性的FMN-NADH 氧化還原酶，實現了重組大腸桿菌雙酶體外的發光，并應用于NADH的檢測。
[0015] 重組大腸桿菌RosettaDE3作為克隆表達外源基因的常見菌株，其本身含有 FMN-NADH氧化還原酶，通過導入熒光素酶基因，使重組蛋白熒光素酶得到最佳表達，從而使 得重組大腸桿菌體外發光體系代替發光細菌的檢測成為可能。利用重組大腸桿菌體外發光 體系用于NADH的定量檢測，檢測NADH標準溶液的線性關系和發光細菌體外發光體系一樣 好，相比之前發光細菌體外發光體系的檢測成本大大降低，且制備量擴大。
【附圖說明】
[0016] 圖1是重組大腸桿菌熒光素酶-FMN:NADH氧化還原酶雙酶體外發光體系的發光性 能；
[0017] 圖2是重組大腸桿菌熒光素酶-FMN:NADH氧化還原酶體外發光體系檢測NADH的 標準曲線。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發 明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落 入本發明保護范圍。
[0019] 在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等 均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常 規方法。
[0020] 本發明所述鰒發光桿菌熒光素酶基因，具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，該 基因提取自鰒發光桿菌（Photobacterium leiognathi)YL菌株，該菌株是由中國海洋大學 食品安全實驗室自行分離，現保存于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC M206139。
[0021] 實施例1熒光素酶基因LuxAB在大腸桿菌RosettaDE3中的克隆與表達
[0022] 將鰒發光桿菌中編碼熒光素酶的LuxAB基因進行PCR擴增，并經限制性內切酶 BamHI和Xhol酶切后，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（BPI)進行回收；與酶切回收后的 質粒pET_28a(+)進行連接反應，再將連接產物導入到表達宿主菌大腸桿菌RosettaDE3中， 待測序正確后，用〇.5mMIPTG進行10h誘導表達，并經Ni Sepharose TM 6Fast Flow填料 進行純化得到具有活性的重組熒光素酶蛋白。
[0023] 實施例2大腸桿菌RosettaDE3中FMN :NADH的活性檢測與驗證
[0024] 大腸桿菌RosettaDE3經超聲破碎、離心后提取到的粗酶液，從中取1ml酶液，一 次性快速加入底物FMN-Na 0. 5yL(10mM)和NADH 300 yL(0. 14mM)，進行吸光值測定。吸 光值檢測利用紫外熒光分光光度計掃描測定，檢測條件：設置波長340nm，加入溶液或試劑 后，進行時間掃描，在60s內吸光值的下降可反映出FMN:NADH氧化還原酶活力的大小。
[0025] FMN :NADH氧化還原酶在大腸桿菌rosettaDE3的活力測定結果見表1。
[0026] 表 1
[0027]
【主權項】
1. 一種鰒發光桿菌熒光素酶基因，其具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2. 含有權利要求1所述基因的重組表達載體。
3. 含有權利要求2所述重組表達載體的微生物。
4. 一種鰒發光桿菌熒光素酶，其具有如SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
5. 權利要求4所述鰒發光桿菌熒光素酶在NADH的定量檢測方面的應用。
6. -種利用權利要求1所述鰒發光桿菌熒光素酶基因進行NADH定量檢測的方法，其特 征是該方法包括如下步驟： (1) 采用分子克隆技術將權利要求1所述基因導入到大腸桿菌R〇settaDE3中，誘導表 達熒光素酶； (2) 驗證FMN :NADH氧化還原酶存在于大腸桿菌RosettaDE3中； (3) 重組大腸桿菌粗酶液制備：提取重組大腸桿菌RosettaDE3胞內產物，得到粗酶制 劑，采用該粗酶制劑進行NADH的定量檢測。
7. 根據權利要求6所述的定量檢測方法，其特征在于：定量檢測中采用微弱發光測量 儀在450-490nm下測量體系的發光值。
【專利摘要】本發明涉及一種鰒發光桿菌熒光素酶、編碼該酶的基因及其應用，屬于生物技術領域。本發明提供一種鰒發光桿菌熒光素酶基因，該基因可在大腸桿菌中實現高效的表達并用于NADH的定量檢測，為代替發光細菌雙酶體系的檢測提供可能。本發明通過導入鰒發光桿菌熒光素酶基因LuxAB，優化條件使外源熒光素酶蛋白在大腸桿菌中實現高效的表達，并借助大腸桿菌RosettaDE3本身含有高活性的FMN-NADH氧化還原酶，實現了重組大腸桿菌雙酶體外的發光，并應用于NADH的檢測。
【IPC分類】C12N1-21, C12Q1-66, C12N9-02, C12N15-63, C12N15-53, C12R1-19
【公開號】CN104845986
【申請號】CN201410657326
【發明人】王靜雪, 林洪, 玄冠華
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2014年11月17日