一種軟骨素酶的大規模生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及一種軟骨素酶的大規模生產方法。
【背景技術】
[0002] 硫酸軟骨素酶（chondroitinase, ChSase)，是一類能將多種糖胺聚糖如硫酸軟骨 素、硫酸皮膚素、透明質酸等降解為不飽和二糖及寡糖的裂解酶。該酶在研宄機體內硫酸軟 骨素等糖胺多糖的功能和代謝方面、在治療動脈粥樣硬化、溶解椎間盤突出中破裂的纖維 環或髓核、抗腫瘤、促進神經組織和神經軸的再生和增強軟骨細胞與軟骨的黏附力等方面 有著廣泛的應用前景。此外，低分子的硫酸軟骨素具有粘度小、溶解性好、易吸收及生物利 用度高等特點，又由于硫酸軟骨素在治療風濕病、關節炎、骨質疏松癥、腰椎間盤突出、治療 高血脂癥、防治動脈粥樣硬化和心絞痛、保存角膜及治療角膜損傷等方面有顯著的作用，已 在食品、化妝品及保健品等行業進行應用。而酶解法制備低分子硫酸軟骨素相對于目前廣 泛采用的酸水解法、離子交換法等具有不不需要特設復雜的實驗設備、不污染環境等顯著 特點已成為應用和研宄的趨勢。雖然目前對軟骨素酶有了一定的研宄，但在國外，也就只有 少數來自 Proteus vulgaris 和 Flavobacterium heparinum 的 ChSase ABC、ChSase AC 出 售，但由于菌的產酶效率不高和其他問題，目前沒有并未實現大規模生產，而且價格十分 昂貴。在國內，目前除了少數基礎研宄，生產應用更是比較空白。因此目前急需一種高效、 操作方便、生產周期短、適合大規模生產的方法來解決目前的問題。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種軟骨素酶的大規模生產方法，通過菌種的活化、逐級放 大和在發酵罐中發酵獲得軟骨素酶，從而解決目前軟骨素酶批量生產的空白。
[0004] 本發明的方法根據菌體的對數期和穩定期生長情況和產酶情況的不同，對發酵條 件進行分段實時調整，從而提高了軟骨素酶的生產效率。
[0005] 本發明的軟骨素酶的大規模生產方法，包括如下的步驟：
[0006] 1)菌種活化：
[0007]將食砜節桿菌CGMCC 1. 3977菌種接種到種子培養基中，在28°C、150rpm的條件下 振蕩培養7〇h制成種子液；
[0008] 其中種子培養基的組成如下：硫酸軟骨素0. 8%、MgS04 ? 7H200. 8%、酵母浸粉 0? 6%、KH2P040. 02%、起始 pH 調整為 6 ;
[0009] 2)種子罐發酵：
[0010] 將步驟1)制備的種子培養液按照體積比1. 5%~2. 5%的比例接種到20L種子 罐的發酵培養基中進行發酵培養，發酵溫度為25~30°C，優選為27~29°C，溶氧20%~ 60 %，優選控制在40 %~50 %，攬樣轉速為lOOrpm~150rpm，優選lOOrpm~125rpm ;通氣 量開始為1~4L/min，優選2~3L/min，隨著溶氧降低到臨近20%~60%時，以lL/min的 梯度適時調整；
[0011] 發酵培養液的裝液量為發酵罐容積的50 %~70 %，優選為60 %~65 %。
[0012] 發酵培養液的組成為硫酸軟骨素0? 8%、MgS04 ? 7H200. 8%、酵母浸粉0? 6%、 KH2P040. 02%、起始 pH 調整為 6。
[0013] 3)生產罐發酵：
[0014] 在種子罐發酵的8~16h內，按照體積比1. 5%~2. 5%的比例接種到500L生產 罐的發酵培養基中進行發酵培養，發酵罐的裝液量為50%~70%，優選為60%~65% ;
[0015] 在發酵開始至發酵的4~14h內發酵溫度為25~30°C，優選27~29°C，4~13h 至發酵結束，發酵體系溫度調低為25~27°C，優選為26~27°C ;
[0016] 在發酵開始后的前4~12h，溶氧控制在20 %~60%，優選控制在40 %~50%。 其中相關參數攪拌轉速為l〇〇rpm~150rpm，優選lOOrpm~125rpm，通氣量開始為25~ 50L/min，優選30~40L/min隨著溶氧降低到臨近20%~60%時，以10L/min的梯度適時 調整。
[0017]在發酵開始后的4~12h至發酵結束，溶氧控制在5 %~30 %，優選10 %~20 %， 攪拌不變，通氣適時調整。
[0018] 在發酵開始后的4~14h至發酵結束要進行補料，補料起始時間在發酵溫度降低 調節后的1~4h，優選2~3h開始，補料時間不能提前，提前補料對產酶有很大影響。補料 方法為：
[0019] 以補料培養基中的軟骨素濃度計算，將培養基配制濃度為25%的溶液，按補料液 與發酵體系的體積比為1 :100~1:300向所述的發酵體系中添加補料液。
[0020] 補料的方式為定時補料，每隔2h添加補料培養基一次，直至發酵結束。
[0021] 補料培養基的組成為：硫酸軟骨素鈉90%~100%，酵母浸粉0~10%。
[0022] 發酵過程中每兩小時取樣檢測一次酶活，直至兩次相鄰的酶活不再有增加時結束 發酵過程。
[0023] 本發明的有益效果：
[0024] 通過對食砜節桿菌CGMCC 1. 3977發酵過程的深入研宄，本發明建立了大規模發 酵的細致工藝，這大大提高了軟骨素酶的生產效率，使得軟骨素酶的酶活可達42000/L，比 粗放的發酵提高酶活大于1000%，而且大大縮短了發酵時間，發酵時間由粗放方法的72h 縮短為24h左右。這大大提高了發酵罐的利用效率，降低成本，而且該方法操作簡單易行， 非常適合大規模工業化生產。
【具體實施方式】
[0025] 本發明的方法在軟骨素酶的發酵過程中，前4~14h為發酵的對數期，在開始發酵 后的4~14h直至發酵結束為穩定期。
[0026] 下面結合實例對本發明做進一步的說明，以便本領域內的技術人員參照說明書能 夠具體實施。
[0027] 本發明的菌種為食砜節桿菌CGMCC 1.3977,收藏于中國普通微生物菌種保藏管 理中心。
[0028] 本發明的種子培養基和發酵培養基的組成：
[0029] 硫酸軟骨素 0? 8 %、MgS04 ? 7H200. 8 %、酵母浸粉 0? 6 %、KH2P040. 02 %、起始 pH 調 整為6。
[0030] 本發明中所涉及的軟骨素酶的測定為：
[0031] 取0. 1ml經6000r/min離心10min的發酵上清液和3. 9mL含0. 2%硫酸軟骨素的 0. 02mol/L Tris-HCL溶液，加入5mL的比色管中，37°C水浴反應20min后，立即置于沸水浴 中煮沸5min，對照管以相同的條件加入滅活的發酵上清液，在232nm處測定光吸收值。硫酸 軟骨素在酶催化下形成不飽和雙糖結構，在232nm處有最大光吸收。
[0032] 酶的活力單位為：37°C條件下，每分鐘降解硫酸軟骨素形成1 ymol不飽和雙糖的 酶量。
[0033] 酶活力計算單位公式為：
【主權項】
1. 一種軟骨素酶的大規模生產方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟： 1) 菌種活化： 將食砜節桿菌接種到種子培養基中進行擴大培養獲得種子液； 2) 種子罐發酵 將步驟1)制備的種子培養液按照體積比1. 5%~2. 5%的比例接種到20L種子罐的發 酵培養基中進行發酵培養，獲得種子培養液；發酵條件為：發酵溫度為25~30°C，溶氧控制 在20%~60%，攪拌轉速為100印111~150印111，通氣量開始為1~417111；[11，隨著溶氧降低到 臨近20 %~60 %時，以lL/min的梯度適時調整； 3) 發酵罐發酵 將步驟2)的種子培養液按照體積比1. 5%~2. 5%的比例接種到500L生產罐的發酵 培養基中進行發酵培養，發酵罐的裝液量為50%~70%，發酵體系的溶氧：在發酵開始后 的4~12h至發酵結束，溶氧控制在5%~30%。
2. 如權利要求1所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟2)種子罐發酵的 發酵條件為：發酵溫度為27~29<€，溶氧40%~50%，攪拌轉速為100印111~125印1]1;通氣 量開始為2~3L/min，隨著溶氧降低到臨近40%~50%時，以lL/min的梯度適時調整。
3. 如權利要求1所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的生產罐 種子培養液的轉接時間為種子罐發酵的8~16h內，在菌體生長的對數期末期。
4. 如權利要求1所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的生產罐 發酵溫度：在發酵開始至發酵的4~14h內為25~30°C，4~13h至發酵結束，溫度調低為 25 ~27。。。
5. 如權利要求4所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的生產罐 發酵溫度：在發酵開始至發酵的4~14h內為27~29°C，4~13h至發酵結束，溫度調低為 26 ~27。。。
6. 如權利要求1所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的發酵體 系的溶氧：在發酵開始后的前4~12h，溶氧控制在20%~60% ;其中相關參數攪拌轉速 為100印111~150印111，通氣量開始為25~5017111111，隨著溶氧降低到臨近20%~60%時，以 lOL/min的梯度適時調整。
7. 如權利要求6所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的發酵體 系的溶氧：在發酵開始后的前4~12h，溶氧控制在40%~50% ;其中相關參數攪拌轉速 為IOOrpm~125rpm，通氣量開始為30~40L/min隨著溶氧降低到臨近40%~50%時，以 lOL/min的梯度適時調整。
8. 如權利要求1所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的11.如 權利要求9所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟（3)所述的發酵體系的溶 氧：在發酵開始后的4~12h至發酵結束，溶氧控制在10%~20%。
9. 如權利要求1所述軟骨素酶大規模的生產方法，其特征在于，步驟3)所述的發酵體 系的補料：在發酵開始后的4~14h至發酵結束要進行補料，補料方法為： 以補料培養基中的軟骨素濃度計算，將培養基配制濃度為25%的溶液，按補料液與發 酵體系的體積比為1 :100~1:300向所述的發酵體系中添加補料液； 補料的方式為定時補料，每隔2h添加補料培養基一次，直至發酵結束；
【專利摘要】本發明公開了一種軟骨素酶的大規模生產方法，主要是根據發酵過程中不同時期生長情況和產酶情況對于理化環境和營養條件的不同，對發酵系統進行細節的分段控制，大大提高了硫酸軟骨素酶的生產效率。本發明得到的軟骨素酶比傳統粗放的方法酶活提高大于1000％，發酵周期大大縮短。本發明的生產方法很提高了纖維素酶的生產水平，大大降低了成本，非常適合大規模的生產。
【IPC分類】C12R1-06, C12N9-88
【公開號】CN104845958
【申請號】CN201510275412
【發明人】陳杰, 曹榮軍, 黃婧, 魯濤
【申請人】青島貝爾特生物科技有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月26日