一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體p474n及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體P474N及其應用，屬于遺傳工 程和發酵工程領域。
【背景技術】
[0002] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有：遺傳 信息豐富，代謝改造操作方便；營養需求簡單，分離提取工藝成本低廉；在低pH條件下（甚 至pH〈3. 0)生長良好；能夠耐受高濃度的底物；被FDA認證為GRAS(General Regarded As Safe)微生物，發酵產品具有安全性等優點而成為發酵生產羧酸（乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延 胡索酸、琥珀酸、a -酮戊二酸等）的潛在最適微生物。然而，釀酒酵母在高濃度糖及通風的 條件分批發酵產生大量的乙醇，對于以羧酸為目標產物來說，乙醇的大量積累使得碳流大 量的損失，且釀酒酵母本身不具備羧酸的合成途徑。通過弱化乙醇途徑中的關鍵酶的活性， 可以減少通往乙醇的碳代謝流，從而減少碳流的損失；在此基礎上，可通過阻止或弱化目標 羧酸的進一步代謝，來構建目標羧酸的合成途徑。丙酮酸羧化酶的作用是將丙酮酸轉化為 草酰乙酸，進而可將碳流引入到目標羧酸的合成途徑，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地 描述為"生物閥門"，如何強化丙酮酸羧化反應，將碳流更有效地引入到目標羧酸的合成途 徑，成為代謝工程改造釀酒酵母生產羧酸的一個關鍵問題。已有研宄表明細胞中丙酮酸羧 化酶活性的高低對蘋果酸、琥珀酸、谷氨酸的積累有著重要作用。任何以二元羧酸為目標產 物的釀酒酵母發酵工藝，都將面臨同樣一個問題：如何強化丙酮酸羧化反應，促進碳流由丙 酮酸流向目標羧酸的合成途徑？通過對丙酮酸羧化酶進行定向改造來提高延胡索酸等二 元羧酸的產量目前未見報道，因此，本發明所提供的方案，對于利用釀酒酵母生產羧酸的研 宄具有普遍的意義。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種提高丙酮酸羧化酶活性的方法及基因工程 菌，為代謝工程改造釀酒酵母高效生產延胡索酸及其它二元羧酸打下基礎（注：丙酮酸羧 化酶在釀酒酵母高效生產二元羧酸中的共同作用是將碳流由丙酮酸引入到目標產物的合 成途徑）。本發明在構建乙醇減少、可積累延胡索酸的工程菌的基礎上，通過過量表達源 于米根霉（Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶基因RoPYC，并通過焚光定位確認該酶定位在 釀酒酵母細胞的胞質中，進而對該酶的Proline474位點進行飽和突變，結合生物素濃度添 加，提高了丙酮酸羧化酶的活性，明顯促進了延胡索酸的積累。
[0004] 本發明的第一個目的是提供一種丙酮酸羧化酶突變體，所述突變體是在氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示的親本米根霉丙酮酸羧化酶的基礎上，對第474位的氨基酸進行了 突變。
[0005] 所述突變，在本發明的一種實施方式中，是進行了飽和突變。
[0006] 所述突變體，在本發明的一種實施方式中，是將第474位的脯氨酸突變成為天冬 酰胺。
[0007] 所述親本米根霉丙酮酸羧化酶，在本發明的一種實施方式中，其核苷酸序列是SEQ ID NO. 2所不的序列。
[0008] 本發明的第二個目的是提供一種表達所述突變體的基因工程菌。
[0009] 所述基因工程菌，在本發明的一種實施方式中，是釀酒酵母。
[0010] 所述釀酒酵母，在本發明的一種實施方式中，同時缺失了丙酮酸脫羧酶roci、乙醇 脫氫酶ADH1、延胡索酸酶FUM1。
[0011] 本發明的第三個目的是提供一種利用表達所述突變體的基因工程菌發酵生產二 元羧酸的方法。
[0012] 所述二元羧酸，包括延胡索酸、蘋果酸、琥珀酸、a-酮戊二酸等。
[0013] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，是用于促進延胡索酸的積累。
[0014] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，是在丙酮酸脫羧酶roci、乙醇脫氫酶 ADH1和延胡索酸酶FUM1同時缺失的酵母菌中，過表達所述丙酮酸羧化酶突變體。
[0015] 在本發明的一種實施方式中，所述丙酮酸脫羧酶基因roCl的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脫氫酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶 基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。
[0016] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，還包括在發酵培養過程中添加生物素。所 述生物素添加量可以是0-128 y g/L。
[0017] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，是：將過表達丙酮酸羧化酶突變體的三基 因缺失菌株 Saccharomyces cerevisiae CEN. PK2-1C A F^Cl A ADH1 A FUM1 的種子液，接 種至發酵培養基，與28-32°C、150-250rpm條件下進行培養。
[0018] 所述方法，在本發明的一種實施方式中，具體是將30°C、220rpm下培養24h的基因 工程菌種子以5%的接種量轉入發酵培養基于30°C、220rpm條件下培養96h。
[0019] 本發明還要求保護所述突變體以及所述突變體得到的延胡索酸在食品、飼料、化 工、藥物制備等方面的應用。
[0020] 本發明的突變體命名：是以SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列為基準，采用"原始氨基 酸位置替換的氨基酸"來表示突變體。比如P474N代表將位置474的氨基酸由親本的脯氨 酸（Pro, P)替換為天冬酰胺（Asn，N)。
[0021] 本發明的有益效果：（1)對米根霉的丙酮酸羧化酶的P474位點進行飽和突變， 得到了比酶活提高的丙酮酸羧化酶突變體P474N，其比酶活較親本提高了 12.8% ; (2)構 建了過表達丙酮酸羧化酶突變體的釀酒酵母，能夠有效提高二元羧酸的產量，為高效生產 延胡索酸及其它二元羧酸創造了條件，具有很好的工業應用價值和前景；在丙酮酸脫羧 酶H)C1、乙醇脫氫酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同時缺失的酵母菌的延胡索酸產量提高了 13. 3% ; (3)通過在發酵過程中添加生物素，可使延胡索酸產量達到357mg/L。
【附圖說明】
[0022] 圖1 :RoPYC-GFP蛋白定位觀察；
[0023] 圖2 :丙酮酸羧化酶突變菌株的富馬酸產量對比圖；
[0024] 圖3 :RoPYC P474位點定點突變對丙酮酸羧化酶活性的影響；
[0025] 圖4 :不同濃度生物素添加對表達P474N的工程菌的延胡索酸積累的影響。
【具體實施方式】
[0026] 乙醇、殘糖含量及延胡索酸的測定方法：采用高效液相色譜儀（HPLC)檢測。發酵 液經處理且上清液經0. 22 y m微孔濾膜過濾后，利用RID (示差折光檢測器）檢測乙醇和殘 糖含量，利用VWD(紫外檢測器）檢測延胡索酸含量，液相色譜方法如下：高效液相色譜儀為 美國Waters公司產品，型號為1515,色譜柱為Aminex HPX-87H column (Bio-Rad)。柱溫： 35°C;流動相：0. 0275% (v/v)稀硫酸，經0. 22 ym濾膜過濾并除氣；流速：0. 6mL/min ;檢測 時間：25min ;進樣量：20yL。
[0027] 生物量的測定方法（Bio-Rid核酸儀）：用0. 1M HC1稀釋適當的倍數，設定波長為 600nm，取200 y L測定其吸光值。
[0028] 種子培養基：葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去離子水容，pH自然，高壓 滅菌（115°C，20min)。
[0029] 發酵培養基：無氨基酵母氮源3. 4g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分別添 加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸鈣5g/L，裝液量 為40mL/250mL。可添加0-128 y g/L的生物素。
[0030] 酵母轉化方法（質粒）：（1)在3mLYro液體培養基中接入平板活化的釀酒酵母 單菌落，30°C、220rpm培養過夜；（2)倒滿EP管菌液，在4000rpm條件下進行室溫lmin離 心；（3)適量無菌水水洗，在4000rpm條件下進行室溫lmin離心；（4)依次加入1. 0M LiAc 36 y L，10mg/mL ssDNA 10 y L(ssDNA 提前沸水浴 5min，冰上放置 5min)，質粒 500ng，50% PEG240 y L，溫和混勻；（5)42°C熱激30分鐘；（6)在4000rpm條件下進行室溫lmin離心， 加lmL無菌水水洗；（7) 4000rpm離心lmin，留適量水吹吸細胞，涂布選擇性平板，30°C培養 3-5d〇
[0031] 實施例1 :突變位點的選擇
[0032] 如何通過定點突變技術來提高丙酮酸羧化酶的活性，難點在于突變位點的確定。
[0033] 本發明將來源于假單胞菌、芽孢桿菌、根瘤菌、分支桿菌、葡萄球菌、古細菌以及真 核細胞等不同種屬的丙酮酸羧化酶進行氨基酸序列比對，最終選擇對RoPYC的P474進行19 個飽和突變，并將突變菌株進行發酵實驗考察突變對延胡索酸積累的影響。
[0034] 實施例2 :RoPYC在釀酒酵母中的定位研宄
[0035] 1、TEFlpromoter 和 RoPYC 基因 0RF 克隆到 pGFP33 載體
[0036] 按照同源重組試劑盒原理，設計兩端帶有15個堿基以上與載體同源的引物，如表 1，小寫字母為同源臂，大寫字母為PCR引物。
[0037] 表1擴增RoPYC基因的引物
[0038]
【主權項】
1. 一種丙酮酸羧化酶突變體，其特征在于，所述突變體是在氨基酸序列如SEQIDNO.I 所示的米根霉丙酮酸羧化酶的基礎上，對第474位的氨基酸進行了突變。
2. 根據權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述突變體是將第474位的脯氨酸突變 成為天冬酰胺。
3. 表達權利要求1或2所述突變體的基因工程菌。
4. 權利要求1-2任一所述突變體在有機酸生產方面的應用。
5. -種利用權利要求1所述突變體促進延胡索酸積累的方法，其特征在于，所述方法 是在丙酮酸脫羧酶roCl、乙醇脫氫酶ADHl和延胡索酸酶FUMl同時缺失的酵母菌中，過表達 所述丙酮酸羧化酶突變體。
6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脫羧酶基因roci的核苷酸序 列如GeneID:850733所示，乙醇脫氫酶基因ADHl的核苷酸序列如GeneID:854068所示， 延胡索酸酶基因FUMl的核苷酸序列如GeneID:855866所示。
7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在發酵培養過程中添加 生物素。
8. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法是：將過表達丙酮酸羧化酶突變 體的三基因缺失菌株SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1CAPDClAADHlAFUMl的 種子液，接種至發酵培養基，與28_32°C、150_250rpm條件下進行培養；所述發酵培養基中 含有0-128yg/L的生物素。
9. 根據權利要求5-8任一所述方法得到的延胡索酸。
10. 權利要求9所述延胡索酸在食品、飼料、化工、藥物制備方面的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種酶活性提高的丙酮酸羧化酶突變體P474N及其應用，屬于遺傳工程和發酵工程領域。本發明將米根霉的丙酮酸羧化酶的P474位點突變成了天冬酰胺，得到的突變體酶活提高了12.8％。在敲除PDC1和ADH1的基礎上敲除基因FUM1，同時過量丙酮酸羧化酶突變體P474N，發現延胡索酸產量提高了13.3％。同時通過添加64μg/L的生物素，延胡索酸產量達到357mg/L，較不添加生物素時(256.7±3.0mg/L)提高了37％。該發明有效強化了碳代謝流由丙酮酸進入延胡索酸的合成途徑，為構建工程酵母高效生產延胡索酸及其它二元羧酸創造了條件，具有很好的工業應用價值和前景。
【IPC分類】C12R1-865, C12N1-19, C12P7-50, C12N9-00, C12P7-46
【公開號】CN104845948
【申請號】CN201510289056
【發明人】徐國強, 蔣伶活, 吳滿珍, 李鵬越
【申請人】江南大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月29日