定向固定化pega復合型樹酯的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，特別是含有06-烷基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT) 的重組蛋白固定于固體材料表面，以建立MGMT重組蛋白固定化方法。
【背景技術】
[0002] 以固定化蛋白質為核心的酶反應器、生物傳感器、生物芯片等技術對于生物催化、 蛋白質組學、臨床診斷和新藥開發具有重要意義。固定化后蛋白質生物活性強弱是成功構 建上述固定化蛋白質界面的前提和決定因素，也是影響后期催化、識別、診斷和篩選等結果 最為關鍵的因素。因此，蛋白質的高活性固定化方法學研宄不僅能提高上述技術研宄結果 的準確性，而且對揭示生命科學領域蛋白質-蛋白質和蛋白質-小分子藥物相互作用機制、 理解信號傳導過程具有重要意義。
[0003] 目前，將蛋白質固定在固體材料表面的方法一般可分為物理吸附法和化學鍵合 法。物理吸附法簡便，易于操作，且蛋白質的固載量大。然而，由于所用方法無特異性，且蛋 白質與固體材料間作用較弱，該方法所得固定化蛋白質在使用過程中蛋白質易于流失，從 而也影響了研宄結果的準確性。化學鍵合方法中又可分為隨意固定化和定向固定化，隨意 固定化方法一般利用蛋白質結構中的氨基、羧基和巰基等基團，與固體材料表面修飾的醛 基等發生化學反應，通過共價鍵將蛋白質隨意固定在固體表面，此類方法由于固定過程中 蛋白質在固體表面取向和構象不一，容易使其活性位點受到影響。而定向固定化方法可很 好地解決這類問題，可以使蛋白質在固體表面的取向和構象達到統一。本專利就是一種定 向固定化方法，由于重組蛋白中的MGMT標簽在重組蛋白質上的位置是固定的，一般位于目 標蛋白的N末端、C末端或其兩端，因此，不會影響目的蛋白本身的構象和活性位點。本專 利旨在建立一種高選擇性的MGMT標簽融合蛋白的固定化新方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法及應用。
[0005] 本發明采用以下技術方案：
[0006] 定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法，包括以下步驟：
[0007] a、將2-氨基-6-氯嘌呤（化合物A)和4-硝基芐醇（化合物B)加入溶劑中，在 一定溫度和堿性條件下發生Williamson成醚反應，生成4-硝基-芐基鳥嘌呤；如下反應式 所示：
[0008]
【主權項】
1. 定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： a、 將2-氨基-6-氯嘌呤和4-硝基芐醇加入溶劑中，在一定溫度和堿性條件下發生 Williamson成醚反應，生成4-硝基-芐基鳥嗓呤； b、 將4-硝基-芐基鳥嘌呤經叔丁氧羰基保護，在鈀碳催化下常壓加氫，溶劑為四氫呋 喃，在4-二甲氨基吡啶存在的條件下，加入二碳酸二叔丁酯，攪拌還原生成化合物（3); c、 攪拌還原生成化合物（3)，芐氧羰基氯保護的Y-氨基丁酸在乙基二甲基碳二亞胺 和1-羥基苯并三氮唑的存在下，發生偶合反應，生成化合物（5); d、 發生偶合反應生成的化合物（5)經鈀碳加氫還原、分離純化后，在二氯乙烷、1-羥基 苯并三唑的存在下，與表面富含羧基的PEGA反應，并在二氯甲烷、三氟乙酸的作用下，其反 應的摩爾比為1:1~1. 5酸性條件下，脫保護即得芐基鳥嘌呤衍生物修飾的PEGA樹酯（8); e、 含06-烷基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標簽一類蛋白質與芐基鳥嘌呤修飾的樹酯直 接混合后，即可發生高效的烷基轉移反應，將以硫醚共價鍵的形式定向固定在PEGA樹酯表 面。
2. 如權利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，步驟a 中的溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇中的一種或其中任意組合，反應底物摩爾比為1: 1，反應溫度 為80°C，加熱回流時間為0. 5~24小時之間。
3. 如權利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，步驟b 中鈀碳用量為反應原料用量的5%，反應溫度為25°C，攪拌時間為5~8小時。
4. 如權利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，所述步 驟c經芐氧羰基保護的反應條件為：NaOH水溶液，室溫反應14小時后可得反應產物（4)。 發生偶合反應的條件為：加入乙基二甲基碳二亞胺反應0. 5小時之后，加入1-羥基苯并三 氮唑，攪拌反應2小時可得反應產物（5)。
5. 如權利要求1所述的定向固定化PEGA復合型樹醋的制備方法，其特征在于，所述步 驟e中06-烷基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶標簽一類蛋白質為a-型受體、0 -型受體、M-型受 體、N-型受體、血管緊張素受體AT的任一種。
6. 如權利要求1-5任一所述的定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法方法制得的定 向固定化PEGA復合型樹酯。
7. 如權利要求6所述的定向固定化PEGA復合型樹醋，其特征在于，定向固定化PEGA復 合型樹酯應用于制備具有特異性識別作用的試劑診斷盒。
【專利摘要】本發明公開了定向固定化PEGA復合型樹酯的制備方法及應用，以2-氨基-6-氯嘌呤和4-硝基芐醇為原料，發生Williamson成醚反應，合成4-硝基-芐基鳥嘌呤，經叔丁氧羰基保護還原，與芐氧羰基氯保護的γ-氨基丁酸在乙基二甲基碳二亞胺和1-羥基苯并三氮唑的存在下，發生偶合反應。經還原、分離純化，與PEGA反應，脫保護即得芐基鳥嘌呤衍生物修飾的PEGA樹酯，與含MGMT標簽的一類蛋白質發生烷基轉移反應，將以硫醚共價鍵的形式定向固定在PEGA樹酯表面。該方法反應穩定、步驟簡單，制備的產物可在固體材料表面形成穩定、均勻、取向統一的蛋白質涂層，用于制備具有特異性識別作用的試劑診斷盒。
【IPC分類】C07K17-08
【公開號】CN104844710
【申請號】CN201510175637
【發明人】趙新鋒, 鄭曉暉, 張亞軍, 肖超妮, 王靜
【申請人】西北大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年4月13日