-單磷酸類脂a的制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種低毒含五條脂肪酸鏈的Kd〇2-單磷酸類脂A的制備與應用，屬于 生物工程領域。
【背景技術】
[0002] 脂多糖（LPS)，即細菌內毒素，是構成大多數革蘭氏陰性細菌外膜外層的主要成 分，主要由Kdo2-類脂A(Kdo2-LipidA)，核心多糖（Core)和0-抗原（O-antigen)三部分組 成；其中Kd〇2-類脂A是LPS的疏水端，其結構非常保守，連接著親水的核心多糖和0-抗原 并協助二者粘附于細胞表面構成完整細胞壁，核心多糖和0-抗原部分具有異構性，不同的 革蘭氏陰性菌株甚至同一菌株內糖基種類、個數、位置都有多種組合形式。革蘭氏陰性菌侵 入宿主后會釋放其表層的LPS，LPS可以被宿主免疫細胞表面的Toll樣受體4(TollLike Rec印tor4,TLR-4)識別，繼而引發細胞內一系列的生理生化反應，產生TNF-a、IL-6、 IL-8等多種炎性細胞因子。其中，Kd〇2-類脂A是與TLR-4受體結合的主要部分，尤其是類 脂A部分的精細結構決定了LPS刺激細胞后釋放的細胞因子種類和數量。
[0003] 野生型大腸桿菌和沙門氏菌的LPS中，類脂A部分包含六條或七條脂肪酸鏈，并在C1位和C4'位有兩個磷酸基團，具有較高的細胞毒性。某些特殊結構、低毒性的類脂A可 作為疫苗佐劑，非特異性地增強機體對抗原的免疫應答反應，提高疫苗效率。但是，由于類 脂A分子水溶性非常低，在水相中不能展現有效的生物活性，所以近幾十年至今，基礎科研 或者臨床上還是使用LPS粗樣來對相應的類脂A衍生物生物活性進行研宄。然而，LPS由 于分子量大、核心糖及〇抗原部分結構多樣化，無法通過質譜或核磁共振的方法進行實時 檢測和快速鑒定，也暫無標準化的提取純化方法。且實際類脂A疫苗佐劑生產中，現用到的 沙門氏菌是致病菌，具有一定的安全隱患，且沙門氏菌同時生產多種不同結構的類脂A，提 取過程繁瑣、能耗高。
[0004] 大腸桿菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含0-抗原，只有Kd〇2-類脂A與核心 多糖，且其Kd〇2-類脂A部分結構單一，是優于沙門氏菌的工業生產出發菌株。本發明改造 大腸桿菌，合成了一種具有特殊結構、低毒的Kd〇2-類脂A，這種Kd〇2-類脂A不連接核心多 糖長鏈、僅由兩個2-酮-3-脫氧辛酸、五條脂肪酸鏈和C4'位單個磷酸構成。這種特別的 Kd〇2-類脂A具有雙親性質，便于分離提取和純化，能夠被實施檢測和直接鑒定，且保持了類 脂A部分的生物活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，是優于類脂A和LPS分 子的、極具發展潛力的疫苗佐劑。同時，本發明提供一種提取和純化Kd〇2-類脂A的標準化 方法，步驟簡單明了，易于操作。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的第一個技術問題是提供一種具有特殊結構、低毒的、五脂肪酸鏈Kd〇2-單磷酸類脂A，其化學式為C96H175N2035P，分子質量為1947. 17,其結構包含2個a-酮 基-3-脫氧-D-甘露辛酸（Kdo)、2個氨基葡萄糖、1個磷酸基團和5條脂肪酸鏈，是以 0_(1' -6)連接的D-葡萄糖胺二糖為骨架，6'位連接二a-酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸 (Kd〇2)，4'位被磷酸化，2'位氨基連接（R)-3-(十二烷氧基）十四烷基，3'位、3位和2位氨 基分別連接十四烷氧基而構成，具體結構式如式I所示。該化合物具雙親性，能夠被有機體 系直接提取同時可被ESI質譜直接檢測鑒定；在水相體系有較好溶解度，能特異性地通過 TLR4/MD2受體激活先天性免疫系統，但同時展現出低細胞毒性，具有作為免疫佐劑的潛力。 [0006]
【主權項】
1. 一種低毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A，其特征在于，化學式為 C96H175N2O35P,其結構包含2個a-酮基-3-脫氧-D-甘露辛酸、2個氨基葡萄糖、1個磷酸基 團和5條脂肪酸鏈，是以0-(1' -6)連接的D-葡萄糖胺二糖為骨架，6'位連接二a-酮 基_3_脫氧-D-甘露辛酸，4'位被磷酸化，2'位氨基連接（R) _3_(十二烷氧基）十四烷基， 3'位、3位和2位氨基分別連接十四烷氧基而構成。
2. -種產低毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A的大腸桿菌基因工程菌， 其特征在于，所述基因工程菌的基因型為E.coliW3110AwaaCFAIacIAlpxMlacZ::Fnlp xE〇
3. -種構建權利要求2所述的大腸桿菌基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步 驟： 1) 將人工構建的IacI敲除片段轉化入E.coliW3110/pKD46感受態細胞中，獲得突變 株E.coliW31101acl: :Pkan，通過Cre酶介導的IoxP位點特異性重組去除卡那霉素抗性基 因； 2. FnlpxE片段電轉入步驟1)制備的E.coliW3110AlacI/pKD46感受態細胞中，獲得 重組菌，其基因型為E.coliW3110AIacIlacZ: :FnlpxE-Fkan，通過FLP酶介導的FRT位點 的特異性重組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，構建成中間菌株HWOOl; 3)在HWOOl突變株的基礎上轉入人工構建的IpxM敲除片段轉化入HW001/pKD46感受 態細胞中，獲得重組菌E. coli W3110 A IacIlacZ: :FnlpxE IpxM: :Pkan，再次通過Cre酶介 導的IoxP位點的特異性重組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，構建成中間菌株HW002 ; 4) 在HW002突變株的基礎上將人工構建的waaCF敲除片段轉化入HW002/pKD46感受態 細胞中，獲得重組菌E.coliHW002waaCF:Pkan，再次通過FLP酶介導的FRT位點的特異性重 組分別去除其中的卡那霉素抗性基因，最終基因型為E.CoIiW3110AwaaCFAIpxMAIacI1 acZ: :FnlpxE，構建成基因工程菌株BW002。
4. 一種應用權利要求2所述大腸桿菌基因工程菌生產低毒的、含有五條脂肪酸鏈的 Kdo2-單磷酸類脂A的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1)搖瓶發酵培養菌體，（2)收 集菌體，氯仿/甲醇/水混合相體系提取分離單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒Kdo2-類脂，（3) DEAE纖維柱純化單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒Kdo2-單磷酸類脂A。
5. 權利要求1所述單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2_單磷酸 類脂A的應用。
6. 權利要求1所述單磷酸五條脂肪酸鏈的減毒的、含有五條脂肪酸鏈的Kdo2_單磷酸 類脂A在制備疫苗佐劑中的應用。
7. 權利要求2所述大腸桿菌基因工程菌在在制備疫苗佐劑中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種低毒含五條脂肪酸鏈的Kdo2-單磷酸類脂A的制備與應用，屬于生物工程領域。本發明改造大腸桿菌，合成了一種具有特殊結構、低毒的、五鏈Kdo2-單磷酸類脂A，這種Kdo2-類脂A分子不連有核心多糖長鏈、僅由兩個2-酮-3-脫氧辛酸、五條脂肪酸鏈和C4’位單個磷酸構成。該Kdo2-類脂A具有雙親性質，便于分離提取和純化，能夠被實施檢測和直接鑒定，且保持了類脂A部分的生物免疫活性，較野生型W3110的LPS也有明顯的減毒作用，是極具發展潛力的疫苗佐劑。同時，本發明提供的提取和純化該Kdo2-類脂A的方法，步驟簡單明了，易于操作。
【IPC分類】C12R1-19, C07H1-06, A61K39-39, C07H13-04, C12P19-26, C12N1-21
【公開號】CN104844665
【申請號】CN201510282822
【發明人】王小元, 王碧雯, 韓亞寧, 李燁, 李顏顏
【申請人】江南大學
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年5月28日