用于增強酶活性的方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的奪叉參考
[0002] 本申請要求2012年12月7日提交的美國臨時專利申請第61/734, 918號以及2013 年3月15日提交的美國臨時專利申請第61/801，982號的權利，其公開內容在此全部并入 以供參考。
技術領域
[0003] 本公開內容大體上涉及增強酶的活性，并且更具體地涉及在例如由生物質中的纖 維素制備糖的過程中使用某些聚合物來增強酶的活性和穩定性。
【背景技術】
[0004] 酶被用在多種商業應用中，包括食品和農業工業、制藥工業、以及化學和生物燃料 工業。例如，可以使用纖維素酶例如內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和e-葡糖苷酶來將生物 質的纖維素組分轉化成用于制造生物燃料的可發酵糖。總體上，這些纖維素酶已從各種各 樣的有機體中分離，并表現出最適宜的溫度、pH和底物范圍。然而，纖維素酶的成本，常常 成為使用該酶的工藝的商業化過程中的障礙。
[0005] 與酶水解有關的成本能夠通過在相同酶負載下增加水解產率或增加反 應器生產能力來降低。已研宄分子生物學方法來改善酶功能并減少底物頑拗性 (recalcitrance)〇 參見WilsonDB.，Curr.Opin.Biotech.，2009,20:295-299。涉 及在水解混合物中包括大分子"添加劑"如表面活性劑的另外可選的方法也已被用 于增加酶產率。參見ErikssonT等人，EnzymeMicrob.Tech.，2002, 31:353-364 ; KaarWE&HoltzappleMT.,Biotechnol.Bioeng., 1998,59(4) :419-427; KristensenJB等人，EnzymeMicrob.Tech. ,2007, 40:888-895;KumarR&Wyman CE.，Biotechnol.Bioeng.,2008， 102(6):1544-1557;QingQ等人，Bioresource Technol.，2010, 101:5941-5951;SiposB等人，C.R.Biol.，2011，334:812-823 ;以及Zheng Y等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，2008, 146:231-248。然而，這些添加劑在何種水平增 強酶活性可能基于多種因素變化，包括酶負載、底物預處理、水解溫度、以及底物和酶的選 擇。因此，本領域需要的是更一致且可靠、在工業規模上可行的能夠改善酶的活性和穩定性 的方法。
[0006] 與酶水解有關的成本還能夠通過經多輪處理以收集和再利用酶而被降低。例 如，已經完成了在固定纖維素酶領域的工作，包括其共價連接或吸附在例如二氧化硅 晶片、硅石、玻璃珠、藻酸鈣珠和磁性納米顆粒的底物上。參見例如，Ogeda等人，J. Biotechnol. 2012, 157, 246-252;Lupoi等人，Biotechnol.Bioeng. 2011，108, 2835-2843 ; Mandali&Dalaly,ASTMIntern. 2010, 7, 1-10；Andriani等人,Bioprocess.Biosyst. Eng. 2012, 35, 29-33 ;Jordan等人，gala,C.J.Mol.Catal.B-Enzym. 2011, 68, 139-146;Xu 等人，Biocatal.Biotransfor. 2011, 29, 71-76。還已經完成了在涉及可逆可溶-不可溶聚 合物-纖維素酶材料的領域內的工作，最通常使用pH敏感聚合物如EudragitL-100或甲 基丙稀酸聚合物。參見例如，Taniguchi等人，Biotechnol.Bioeng. 1989, 34, 1092-1097 ;Liang&Cao,X.BioresourceTechnol.2012，116，140-146;Zhang等人,Biocatal. Biotransfor. 2010, 28, 313-319。然而，這些材料將工業操作限制在相當窄的pH范圍內且 需要多重PH調節以回收和再利用該酶。因此，本領域還需要的是在工業規模上可行的能夠 通過經多輪處理以再循環酶來降低酶成本的替代方法。
【發明內容】
[0007] 本文提供了在一種或多種底物分解（例如，水解）的過程中增加酶活性或減少酶 或酶的混合物變性的方法，通過使底物與酶或酶的混合物以及至少一種本文所述聚合物接 觸。能夠在本文所述聚合物存在下分解至少一部分底物的任何合適的酶或酶的混合物可以 被用于所提供的方法中。合適的酶可以包括，例如，纖維素酶、半纖維素酶、木質酶、脂酶、淀 粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。例如，酶可以是內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、e-葡糖苷酶、或 多糖單加氧酶、或者任何這些酶的混合物，且底物可以是，例如，生物質、纖維素、二糖和其 他多糖。這樣的酶在本文所述聚合物的存在下可以使底物水解以產生糖。
[0008] 本文還提供了通過使底物與酶和至少一種本文所述聚合物接觸以對底物進行預 處理的方法，包括至少一種本文所述聚合物，以產生預處理的底物，其中與未經該預處理的 底物的水解相比，預處理底物隨后的水解引起更高的產率。
[0009] 用于本文所述任何方法的聚合物可以包括多個具有式（I)結構的單體殘基：
[0010]
【主權項】
1. 一種方法，包括使至少一種底物與至少一種酶和至少一種聚合物接觸，所述聚合物 包括多個具有式（I)結構的單體殘基： 其中：
R1在每次出現時獨立地為H或烷基；并且 Ra和Rb在每次出現時獨立地為H、未取代或取代的脂肪族基團、未取代或取代的脂環族 基團、未取代或取代的芳基、未取代或取代的雜芳基、或者未取代或取代的雜環基； 條件是Ra和R B中的至少一個不是H。
2. 根據權利要求1所述的方法，還包括酶促分解至少一部分的所述底物以產生至少一 種產物。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，還包括通過將至少一種所述聚合物從所述至少一 種產物中分離而回收至少一種所述聚合物。
4. 根據權利要求3所述的方法，還包括： i) 提供另外的底物、另外的酶或酶的混合物、以及至少一種所回收的聚合物； ii) 使所述另外的底物與所述另外的酶或酶的混合物在至少一種所回收的聚合物的存 在下接觸；以及 iii) 酶促分解至少一部分的另外的生物質。
5. 根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中具有式（I)結構的單體殘基是式 (I-Al)的單體殘基：
其中： Rai在每次出現時是未取代或取代的-脂肪族基團-、未取代或取代的-脂環族基團-、 未取代或取代的-芳基_、未取代或取代的-雜芳基_、或者未取代或取代的-雜環基-;并 且 Ra2和Ra3在每次出現時獨立地為H、未取代或取代的脂肪族基團、未取代或取代的脂環 族基團、未取代或取代的芳基、未取代或取代的雜芳基、或者未取代或取代的雜環基。
6. 根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中具有式（I)結構的單體殘基是式 (I-A2)的單體殘基：
7. 根據權利要求6所述的方法，其中式（I-A2)的單體殘基是：
8. 根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其中至少一種所述聚合物是均聚物或共聚 物。
9. 根據權利要求8所述的方法，其中所述共聚物包括： 多個式（I-A2)的第一單體殘基： 其中：
R1為H或烷基； Ra為未取代的烷基；且 Rb為H ;以及 多個式（I-A2)的第二單體殘基， 其中： R1為H或烷基； Ra為未取代的烷基、或被1-5個-OH基取代的烷基； Rb 為 H， 條件是所述第一單體殘基的R1、Ra和R B中的至少一個不同于所述第二單體殘基的R \ Ra^P Rb〇
10. 根據權利要求9所述的方法，其中：
11.根據權利要求8所述的方法，其中所述共聚物還包括多個獨立地具有式（II-Bl)或 (II-B2)結構的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺單體殘基：
其中： R1在每次出現時獨立地為H或烷基； r在每次出現時獨立地為大于或等于1的整數； X在每次出現時獨立地為未取代或取代的-脂肪族基團-、未取代或取代的-脂環族基 團_、未取代或取代的-芳基_、未取代或取代的-雜芳基_、未取代或取代的-雜環基_、未 取代或取代的-醚_、或-(CH 2) jNHCO-，其中j為整數，且j在每次出現時獨立地至少為1 ; 并且 R2和R3在每次出現時獨立地為H、未取代或取代的脂肪族基團、未取代或取代的脂環族 基團、未取代或取代的芳基、未取代或取代的雜芳基、未取代或取代的雜環基、或-C(O)Ra, 其中RaS H、烷基或羥基；或者R 2和R 3連同與其連接的碳一起形成5-或6-元未取代或取 代的雜環基。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中式（II-Bl)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺單體 殘基具有式（II-Bla)或（II-B2a)的結構：
13. 根據權利要求11-12中任一項所述的方法，其中X在每次出現時是-乙二 醇-或 _ (CH2) jNHCO-。
14. 根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中至少一種所述聚合物是熱響應性 的。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中至少一種所述聚合物具有至少10°C的LCST。
16. 根據權利要求1-15中任一項所述的方法，其中所述至少一種酶選自纖維素酶、半 纖維素酶、木質酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。
17. -種水解生物質的方法，包括： a) 提供生物質、水解酶和熱響應聚合物； b) 使所述生物質與所述水解酶在所述熱響應聚合物的存在下接觸， 其中所述熱響應聚合物為： 聚N-異丙基丙烯酰胺， 聚N-異丙基甲基丙烯酰胺，或者 包括多個第一單體殘基和多個第二單體殘基的共聚物，其中各個所述第一單體殘基獨 立地選自N-異丙基丙烯酰胺、N-異丙基甲基丙烯酰胺及其任意組合，且各個所述第二單體 殘基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺單體殘基；以及 c) 水解至少一部分的所述生物質以產生糖。
18. -種組合物，包括： 至少一種底物； 至少一種酶；以及 至少一種聚合物，所述聚合物包括多個具有式（I)結構的單體殘基：
其中： R1在每次出現時獨立地為H或烷基；并且 Ra和Rb在每次出現時獨立地為H、未取代或取代的脂肪族基團、未取代或取代的脂環族 基團、未取代或取代的芳基、未取代或取代的雜芳基、或者未取代或取代的雜環基； 條件是Ra和R B中的至少一個不是H。
19. 一種組合物，包括： 至少一種殘余底物； 至少一種產物； 至少一種酶；以及 至少一種聚合物，所述聚合物包括多個具有式（I)結構的單體殘基：
其中： R1在每次出現時獨立地為H或烷基；并且 Ra和Rb在每次出現時獨立地為H、未取代或取代的脂肪族基團、未取代或取代的脂環族 基團、未取代或取代的芳基、未取代或取代的雜芳基、或者未取代或取代的雜環基； 條件是Ra和R B中的至少一個不是H。
20. 根據權利要求18或19所述的組合物，其中所述至少一種酶選自纖維素酶、半纖維 素酶、木質酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。
【專利摘要】本文提供的是用某些可以任選地與酶連接的聚合物來增強酶活性的方法。聚合物可以是熱響應聚合物，包括聚N-異丙基丙烯酰胺或聚N-異丙基甲基丙烯酰胺。聚合物還可以是具有至少兩種不同單體殘基的共聚物。單體殘基可以具有式(I)的結構：其中R1、RA和RB如說明書所述。這樣的單體殘基的實例可以包括N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)和N-異丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)。聚合物可以包括另外的單體殘基，如具有氨氧基的甲基丙烯酰胺單體殘基，其可以被改性以改變聚合物的低臨界溶解溫度(LCST)。
【IPC分類】C08F20-56, C12N11-08, C12P19-14
【公開號】CN104838011
【申請號】CN201380064084
【發明人】M·B·弗朗西斯, K·J·麥肯齊
【申請人】加利福尼亞大學董事會
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2013年12月6日
【公告號】WO2014089510A1