轉基因玉米mon88017品系特異定量pcr精準檢測的引物和探針及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術】
[0002] 國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產 品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁皇，同時彌補和完 善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和 選擇權，建立一種新型轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。
[0003] 目前關于轉基因玉米M0N88017的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法， 尚無關于擴增檢測轉基因玉米M0N88017及產品的品系特異性某特定位點（基因序列）的 高靈敏度定量PCR精準檢測技術。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高和靈敏度高的檢測轉基因玉 米M0N88017及產品的品系特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。
[0005] 本發明通過下述技術方案實現：
[0006] 轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測的引物和探針，
[0007]其中，
[0008]上游引物序列：EventM0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
[0009]下游引物序列：EventM0N88017-Reverse:5'-CCGGACATGAAGCCAITTACA-3'；
[0010] 熒光探針序列：
[0011]EventM0N88017-Probe:5' -FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3' 〇
[0012] 轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測方法，包括以下步驟：
[0013](1)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
[0014]上游引物序列：EventM0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3'；
[0015]下游引物序列：EventM0N88017-Reverse:5,-CCGGACATGAAGCCAITTACA-3，；
[0016] 熒光探針序列：
[0017]EventM0N88017-Probe:5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3'；
[0018] (2)制備M0N88017品系的DNA稀釋液；
[0019] (3)配制PCR反應體系；
[0020] (4)定量PCR檢測。
[0021] 進一步地，步驟（1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為10ym〇l/l，步驟（2) 所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/y1。
[0022] 再進一步地，步驟（3)所述的配制PCR反應體系，即將3y 1的DNA稀釋液加入到 反應體系中，所得的反應體系包括以下組分：
[0023]
【主權項】
1. 轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測的引物和探針，其特征在于， 上游引物序列：Event M0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3' ； 下游引物序列：Event M0N88017-Reverse:5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3' ； 焚光探針序列： Event M0N88017-Probe :5'-FAM-CTTTTTTGCCGGAGTATGACGGTGACG-3' 。
2. 轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列：Event M0N88017-Forward:5'-CGCTAGCAGCTCTCCTCCAA-3' ； 下游引物序列：Event M0N88017-Reverse:5'-CCGGACATGAAGCCATTTACA-3' ； 焚光探針序列： Event M〇N88〇17-Pr〇be ： 5'-Fam-Cttttttgccggagtatgacggtgacg-S'； (2) 制備M0N88017品系的DNA稀釋液； (3) 配制PCR反應體系； (4) 定量PCR檢測。
3. 根據權利要求2所述的轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測方法，其 特征在于，步驟（1)所述合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟（2)所述制備的 DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
4. 根據權利要求3所述的轉基因玉米M0N88017品系特異定量PCR精準檢測方法，其 特征在于，步驟（3)所述的配制PCR反應體系，即將3μ1的DNA稀釋液加入到反應體系中， 所得的反應體系包括以下組分： 2. Taqman Master mix 12. 5M-1 上游引物 ιμL 下游引物 ιμL 熒光探針 0. 8μ1 DNA稀釋液 3. 〇μ1 水 6· 7μ1。
5. 根據權利要求2或4所述的轉基因玉米Μ0Ν88017品系特異定量PCR精準檢測方 法，其特征在于，所述PCR反應條件為：95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，60°C退 火60s，45個循環。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉基因玉米MON88017品系特異定量PCR精準檢測方法。本發明采用設計的特異性上游引物序列Event MON88017-Forward、下游引物序列Event MON88017-Reverse、熒光探針序列Event MON88017-Probe、MON88017品系的DNA稀釋液以及Taqman Master mix（2×）和水配制成PCR反應體系，進行定量PCR檢測。本發明主要建立了一種高擴增效率、高準確度的Taqman定量PCR檢測技術，適用于國內農業轉基因生物及產品監督檢驗、進出境口岸轉基因生物及產品檢驗、企業內部進口原材料含轉基因MON88017品系生物成分檢測。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104830857
【申請號】CN201510280706
【發明人】王東, 宋君, 雷紹榮, 郭靈安, 劉勇, 常麗娟, 張富麗, 尹全, 劉文娟
【申請人】四川省農業科學院分析測試中心
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月27日