一種重組豬偽狂犬病毒TK/gE/gI三基因缺失株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于家畜疫苗制備技術領域,具體涉及一種豬偽狂犬病病毒疫苗。
【背景技術】
[0002] 豬偽狂犬病病毒PRV(Pseudorabiesvirus)屬于痕疼病毒科a痕疼病毒 亞科水泡病毒屬豬皰瘆病毒I型,豬是該病毒的唯一自然宿主,引起豬的偽狂犬病 (Pseudorabies,PR)。該病在豬群多呈暴發流行,主要危害母豬群,引起母豬流產或垂直傳 播給仔豬,造成初生仔豬大量死亡,給我國乃至全球的養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前 尚無治療PR的有效藥物,因此疫苗接種成為控制該病發生和流行的主要措施。世界上使用 最廣泛的疫苗主要是PRVBartha-K61株疫苗,然而近幾年我國豬偽狂犬疫病流行現狀為現 有該疫苗不能完全保護新流行PRV的攻擊,給免疫豬場造成了一定的經濟損失。因此,需要 提供最新流行毒株制備的疫苗。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種豬偽狂犬病病毒疫苗,即由篩選出的豬偽狂犬病病毒基 因缺失株作為抗原制備的疫苗,本發明的疫苗對目前流行的豬偽狂犬病病毒的攻擊能夠提 供良好的免疫保護效力。
[0004] 本發明的豬偽狂犬病病毒疫苗,由抗原和保護劑組成的,其中抗原包含有由保藏 編號為CGMCCNo. 10266的豬偽狂犬病病毒株進行毒力基因缺失后制成的減毒病毒株。
[0005] 所述的毒力基因優選為TK、gE和gl基因。
[0006] 其中的保護劑為目前使用的病毒疫苗用保護劑,其一種實施例具體成分為蔗糖和 明膠的水溶液,其在疫苗中的質量百分比終濃度分別為20%和4. 8%。
[0007] 上述的疫苗中加入了抗生素,青霉素、鏈霉素終濃度為200單位/ml;
[0008] 上述的疫苗的制備方法,是采用基因工程的方法將豬偽狂犬病病毒基因組的毒力 基因進行缺失,在細胞上進行拯救,擴毒獲得的病毒液,加入保護劑制成的。
[0009] 本發明制備的疫苗可有效預防豬偽狂犬病,而且作為抗原的豬偽狂犬病病毒為基 因缺失株,通過水平傳播感染在小鼠體連續傳代,均未見毒力返強現象,遺傳性穩定,符合 豬偽狂犬病病毒缺失疫苗株無毒力返強的標準,制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護,具 有很好的商品化開發前景。
【具體實施方式】
[0010] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明,本領域的普通技術人員在本發明技術 方案的基礎上,可以選用本領域常用的方法步驟,而不僅限于本發明說明書實施例的具體 記載。
[0011] 實施例1 :豬偽狂犬病病毒株的選育
[0012] 近年來,我國多個豬場都發生了偽狂犬病,其中大部分是種豬場,而發病豬群之前 已經注射了偽狂犬疫苗,推測感染的病毒發生了變異;因此從發病豬群中進行了豬偽狂犬 病毒的篩選。
[0013] 取發病豬內臟樣本,包括:心臟、肝臟、肺臟、脾臟、扁桃體和淋巴結等。將內臟樣本 與PBS(0.lM,pH7. 2)以V/V1:5制成勻漿,反復凍融3次,3000r/min離心15min,取上清中 加雙抗,37°C感作lh,經0. 22ym濾膜過濾除菌。取lml病毒濾液接種于長成單層的Vero 細胞,盲傳三代,觀察細胞病變(CPE)。將出現CPE的細胞培養液進行空斑純化,純化后的病 毒分裝保存至-70°C備用,并測定病毒含量。選取作為疫苗研制的候選毒株,將豬偽狂犬病 病毒QD株(皰疼病毒I型PorcineherpesvirusTypeI)已于2015年3月6日保藏于 北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國科學院微生物研宄所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心,保藏編號為CGMCCNo. 10266。
[0014] 對于本發明篩選的毒株進行PCR檢測,測序后進行blast分析,發現保藏編號為 CGMCCNo. 10266的豬偽狂犬病病毒的gE基因與2012年之后報道的豬偽狂犬病病毒的相對 應的序列雖然存在至少2個氨基酸的差異,但是親緣關系較近,均處于一個相對獨立的分 支中,與之前分尚的毒株親緣關系較遠。且與最近分尚的毒株具有相同的分子特征,即在gE 基因第48位和第492-496位各有1個天冬氨酸的插入,其他報道也證實也這一點。而以前 分離到的毒株只個別有一個位置插入氨基酸,絕大部分沒有插入。因此可以推測上述的差 異正是導致已有的豬偽狂犬病病毒疫苗免疫效果不佳的原因所在。
[0015] 該毒株作100倍稀釋后,與等量豬偽狂犬病病毒抗血清中和,病毒均能被尚免血 清特異性中和;而與等量豬細小病毒、豬流感病毒、豬瘟病毒、豬圓環病毒2型、豬繁殖與呼 吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒抗血清中和組,細胞呈現明顯的 細胞病變,可見該病毒特異性好。該毒株制備的疫苗免疫BALB/C小鼠后,能降低小鼠的死 亡率。
[0016] 實施例2 :重組豬偽狂犬病毒TK/gE/gl雙基因缺失株的構建
[0017] 從分離的豬偽狂犬病病毒(CGMCCNo. 10266)中提取該分離株的DNA,采用基因工 程的方法對該分離株進行毒力基因TK、gE和gl基因的缺失,并在細胞上進行拯救后命名為 PRV/TK7gE7gI_,繁毒,加入保護劑后作為種子毒。【具體實施方式】如下:
[0018] 1PCR引物
[0019] 參考PRV全基因組序列(BK001744),自行合成系列引物,分別用來擴增TK基因 左右同源臂,以及位于US7(gI)基因和US8(gE)基因兩側(含部分gl和gE基因)的可用 于同源重組的左臂片段(L)和右臂片段(R)。另外同時設計引物擴增EGFP和EGFP真核表 達盒,以及用于鑒定基因缺失的引物。引物序列及預期PCR產物的大小見表1。
[0020] 表1 :本研宄中用到的引物
[0021]
【主權項】
1. 一種豬偽狂犬病減毒病毒株,其特征在于,所述的減毒病毒株是由保藏編號為CGMCC No. 10266的豬偽狂犬病病毒株進行毒力基因缺失后制成的減毒病毒株;所述的毒力基因 為TK、gE和gl基因。
2. 權利要求1所述的減毒病毒株在制備疫苗中的應用。
3. -種疫苗,其特征在于,所述的疫苗由抗原和保護劑組成的,其中抗原包含有權利要 求1所述的減毒病毒株。
4. 如權利要求3所述的豬偽狂犬病疫苗,其特征在于,所述的保護劑為蔗糖和明膠的 水溶液。
5. 如權利要求4所述的豬偽狂犬病疫苗,其特征在于,所述的蔗糖和明膠在疫苗中的 質量百分比終濃度分別為20%和4. 8%。
6. 如權利要求4所述的豬偽狂犬病疫苗,其特征在于,所述的保護劑中添加有抗生素。
7. 如權利要求6所述的豬偽狂犬病疫苗,其特征在于,所述的抗生素為青霉素和鏈霉 素。
【專利摘要】本發明的目的是提供一種豬偽狂犬病病毒疫苗,由抗原和保護劑組成的,其中抗原包含有由保藏編號為CGMCC No.10266的豬偽狂犬病病毒株進行毒力基因TK、gE和gI缺失后制成的減毒病毒株。本發明制備的疫苗可有效預防豬偽狂犬病,而且作為抗原的豬偽狂犬病病毒為基因缺失株,通過水平傳播感染在小鼠體連續傳代,均未見毒力返強現象,遺傳性穩定,符合豬偽狂犬病病毒缺失疫苗株無毒力返強的標準,制成的疫苗能夠提供有效的免疫保護,具有很好的商品化開發前景。CGMCC No.1026620150306
【IPC分類】A61P31-22, C12N7-04, A61K35-763
【公開號】CN104830810
【申請號】CN201510248661
【發明人】李明義, 劉杉杉, 孫偉, 劉陽, 李曉林, 趙航, 李彥鳳, 葛棟, 李佳琪
【申請人】山東信得科技股份有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月15日