一種利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于海洋農業中貝類多倍體檢測技術領域，具體涉及一種利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法。
【背景技術】
[0002]動物的循環系統有開管式循環和閉管式循環2種，開管式循環的血液經心臟、大血管流出后，進入器官間或組織間隙，血液與其細胞直接接觸。閉管式循環的血液始終在血管中流動，血液與其細胞不直接接觸(徐俊延，董秀麗，1998)。對于軟體動物而言，其體腔演化為真假體腔并存形式，真體腔退化為痕跡，殘留在圍心腔以及生殖器官和排泄器官的官腔內，而假體腔廣泛存在于器官組織之間的間隙中，其中充滿血液，成為血竇，是循環系統的一部分。由于血竇的存在，大多數軟體動物循環系統為開管式循環，這種循環與其緩慢的生活方式相適應，但頭足類為閉管式循環，即動靜脈之間有血管相連，與其敏捷快速運動相適應。大多數軟體動物血液是無色的，僅有少量為藍色，內含血青素(王如才等，2008)。
[0003]牡蠣屬于軟體動物門瓣鰓綱牡蠣科動物，循環系統為開管式循環，組織間隙間充滿了體腔液，體腔液中含有大量的血淋巴細胞。由于牡蠣血淋巴為無色透明液體，為此很難辨認出這種透明液體就是血淋巴。過去牡蠣多倍體的倍性檢測過程中，學者們均采用鰓、外套膜、閉殼肌等組織作為實驗材料，利用流式細胞儀進行DNA含量測定，從而判斷倍性組成。這種取樣操作殺死樣品本身，不利于該樣品以后的應用。因此，開發一種操作簡單、無損傷的牡蠣倍性檢測方法將具有重要的科研和實際應用價值。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了簡化利用流式細胞儀檢測DNA含量的步驟，克服當前檢測倍性取樣時會殺死牡蠣樣本的缺陷，而提供一種操作簡單、檢測準確率達100%，且對檢測的牡蠣樣品無損傷的利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法。
[0005]本發明的利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法，其特征在于，其是以牡蠣樣品體腔液中淋巴細胞作為檢測材料，檢測其DNA含量，然后再判定牡蠣樣品的倍性組成。
[0006]優選，所述的利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法，具體步驟為:
[0007]a、淋巴液抽取:將牡蠣樣品放置于海水中，當其自然張開雙殼時，利用注射器插入體腔中，取體腔液；
[0008]b、離心重懸:將體腔液離心后去除上清液，加入海水懸浮，過濾，得淋巴細胞；
[0009]C、細胞核染色:將淋巴細胞用DAPI染液染色；
[0010]d、染色后的樣品混合均勻后檢測其DNA含量，確定牡蠣樣品的倍性組成。
[0011]所述的步驟a的牡蠣樣品優選殼高為30_以上的牡蠣，個體太小，不容易獲得體腔液。
[0012]所述的步驟b的離心，其轉速優選為800-1200r/min，轉速過大，會導致淋巴細胞破裂，轉速過低，淋巴細胞無法沉淀至管底。
[0013]所述的步驟b的過濾優選采用孔徑為50-100 μ m濾網過濾。
[0014]所述的步驟c的將淋巴細胞用DAPI染液染色優選是將淋巴細胞放于DAPI染液(4，，6_ 二脒基-2-苯基卩引噪，4’, 6-diamidino-2-pheny I indole,其配制方法是:將 ImgDAPI干粉和25.9g檸檬酸鈉溶解于500ml去離子水中)中，染色2?3min。染色后的樣品可以直接用于DNA含量檢測，也可以放置于-20°C冰箱中長期保存，之后進行DNA含量測定。
[0015]所述的步驟d的染色后的樣品混合均勻后檢測DNA含量，優選是將染色后的樣品混合均勻后直接通過流式細胞儀在波長488nm通道下檢測DNA含量，確定牡蠣樣品的倍性組成。
[0016]本發明不同于以往牡蠣倍性測定操作，此前的牡蠣DNA含量檢測，均需采用鰓、夕卜套膜、閉殼肌等組織作為樣品，不僅僅需要制備單細胞懸液，而且還要將樣本殺死，導致樣品本身的后續工作很難開展。本發明結合牡蠣具有開管式循環，體腔液中含有大量淋巴細胞的特性，僅僅采用體腔液中的單細胞淋巴作為檢測樣品，不僅僅省略單細胞懸液制備步驟，而且檢測準確率為100%，并可以保證牡蠣樣品本身100%存活，不受到任何傷害，這為牡蠣倍性活體檢測奠定了理論與實踐應用基礎。本發明具有快速、簡便、實用性強等優點。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0018]以下實施例中所用DAPI染液，其配制方法為:將Img DAPI干粉和25.9g檸檬酸鈉溶解于500ml去離子水混合均勻而成。
[0019]實施例1
[0020]a、淋巴液抽取:于2014年11月，從珠海橫琴島取回殼高為50_80mm的香港牡蝴全三倍體樣品100個個體至中國科學院南海海洋研宄所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室，先將其編號，之后放置于溫度為25-27°C、鹽度為18ppt的海水中，5min后，所有牡蠣微微張開雙殼，當其牡蠣自然張開雙殼時，利用注射器輕輕插入香港牡蠣體腔中，當牡蠣感覺到針頭刺入時，會將兩殼緊閉，但不影響體腔液抽取，每只牡蠣抽取1.0ml體腔液，編好號以后放置于離心管中；
[0021]b、離心重懸:將離心管中的體腔液在1000r/min離心，離心后去除上清液，加入0.5ml海水后利用注射器輕輕吹打進行二次懸浮，再用孔徑為50 μ m濾網過濾，得到淋巴細胞；
[0022]C、細胞核染色:向淋巴細胞樣品中加入0.5ml的DAPI染液，染色處理3min ；
[0023]d、倍性測定:處理后的樣品混勻后直接通過流式細胞儀(德國Partec II)在波長488nm通道下檢測DNA含量，確定樣品倍性組成，結果表明:100個個體中，全部為三倍體，與樣品實際情況一致，準確率為100%。之后將抽了體腔液的牡蠣樣品放入扇貝籠中，在牡蠣養殖區養成，檢測后的三倍體樣品均正常生長，90天內100%存活。
[0024]實施例2
[0025]a、淋巴液抽取:于2014年12月，從珠海取回殼高為50_80mm的香港牡蠣二三倍體混合樣品50個個體至中國科學院南海海洋研宄所湛江海洋經濟動物實驗站，先將其編號，之后放置于溫度為25-27 °C、鹽度為ISppt的海水中，Smin后，所有牡蠣微微張開雙殼，當其牡蠣自然張開雙殼時，利用注射器輕輕插入香港牡蠣體腔中，當牡蠣感覺到針頭刺入時，會將兩殼緊閉，但不影響體腔液抽取，每只牡蠣抽取0.SmL體腔液，編好號以后放置于離心管中；
[0026]b、離心重懸:將離心管中的體腔液在800r/min離心，離心后去除上清液，加入0.5ml海水后利用注射器輕輕吹打進行二次懸浮，再用孔徑為100 μ m濾網過濾，得淋巴細胞；
[0027]C、細胞核染色:向淋巴細胞樣品中加入0.5ml的DAPI染液，染色處理2min ；
[0028]d、倍性測定:處理后的樣品混勻后直接通過流式細胞儀(德國Partec II)在波長488nm通道下檢測DNA含量，確定樣品倍性組成，結果表明:50個個體中，三倍體36個，14個為二倍體，與實際情況一致，檢測準確率為100%。將抽了體腔液的二三倍體牡蠣樣品分開后，放入扇貝籠中，在牡蠣養殖區養成，發現二三倍體牡蠣樣品均正常生長，60天內100%存活。
[0029]實施例3
[0030]a、淋巴液抽取:于2014年12月，從北海取回殼高為30_60mm的香港牡蠣二三倍體混合樣品50個個體至中國科學院南海海洋研宄所湛江海洋經濟動物實驗站，先將其編號，之后放置于溫度為25-27°C、鹽度為ISppt的海水中，1min后，牡蠣全部微微張開雙殼，當其牡蠣自然張開雙殼時，利用注射器輕輕插入香港牡蠣體腔中，當牡蠣感覺到針頭刺入時，會將兩殼緊閉，但不影響體腔液抽取，每只牡蠣抽取0.5mL體腔液，編好號以后放置于離心管中；
[0031]b、離心重懸:將離心管中的體腔液在1200r/min離心，離心后去除上清液，加入0.5ml海水后利用注射器輕輕吹打進行二次懸浮，再用孔徑為50 μ m的濾網過濾，得淋巴細胞；
[0032]C、細胞核染色:向淋巴細胞樣品中加入0.5ml的DAPI染液，染色處理3min，之后放置于-20°C冰箱中，保存3個月；
[0033]d、倍性測定:將步驟c的保存3個月的樣品解凍后，混勻直接通過流式細胞儀(德國Partec II)在波長488nm通道下檢測DNA含量，確定樣品倍性組成，結果表明:50個個體中，三倍體41個，9個為二倍體，與實際情況一致，檢測準確率為100%。將抽了體腔液的二三倍體牡蠣樣品分開后，放入扇貝籠中，在牡蠣養殖區養成，發現二三倍體牡蠣樣品均正常生長，60天內100%存活。
【主權項】
1.一種利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法，其特征在于，其是以牡蠣樣品體腔液中淋巴細胞作為檢測材料，檢測其DNA含量，然后再判定牡蠣樣品的倍性組成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法，具體步驟為: a、淋巴液抽取:將牡蠣樣品放置于海水中，當其自然張開雙殼時，利用注射器插入體腔中，取體腔液； b、離心重懸:將體腔液離心后去除上清液，加入海水懸浮，過濾，得淋巴細胞； c、細胞核染色:將淋巴細胞用DAPI染液染色； d、染色后的樣品混合均勻后檢測其DNA含量，確定牡蠣樣品的倍性組成。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟a的牡蠣樣品是殼高為30_以上的牡蠣。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟b的離心，其轉速為800-1200r/min。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟b的過濾是采用孔徑為50-100 μ m濾網過濾。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟c的將淋巴細胞用DAPI染液染色是將淋巴細胞放于DAPI染液中，染色2-3min，染色后的樣品直接用于DNA含量檢測或放置于-20°C冰箱中長期保存，之后進行DNA含量檢測。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步驟d的染色后的樣品混合均勻后檢測DNA含量是將染色后的樣品混合均勻后直接通過流式細胞儀在波長488nm通道下檢測DNA含量，確定牡蠣樣品的倍性組成。
【專利摘要】本發明公開了一種利用牡蠣體腔液中淋巴細胞檢測牡蠣倍性的方法。它是以牡蠣樣品體腔液中淋巴細胞作為檢測材料，檢測其DNA含量，然后再判定牡蠣樣品的倍性組成。本發明不同于以往牡蠣倍性測定操作，此前的檢測，均需采用鰓、外套膜、閉殼肌等組織作為樣品，不僅僅需要制備單細胞懸液，而且還要將樣本殺死，導致樣品本身的后續工作很難開展。本發明結合牡蠣具有開管式循環，體腔液中含有大量淋巴細胞的特性，僅僅采用體腔液中的單細胞淋巴作為檢測樣品，不僅僅省略單細胞懸液制備步驟，而且檢測準確率為100％，并可以保證牡蠣樣品本身100％存活，不受到任何傷害，這為牡蠣倍性活體檢測奠定了理論與實踐應用基礎。本發明具有快速、簡便、實用性強等優點。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104818327
【申請號】CN201510194867
【發明人】李軍, 張揚, 張躍環, 喻子牛
【申請人】中國科學院南海海洋研究所
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2015年4月22日