一次性檢測腸癌多重基因突變的引物、探針、檢測體系和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體地涉及肺癌多重基因突變的引物、探針、及檢測試 劑盒和體系。
【背景技術】
[0002] 大腸癌是在世界范圍內發病率第三的惡性腫瘤，死亡率高居第二，大約每年新增 一百二十萬患者。在中國，所有惡性腫瘤中，大腸癌己經一躍成為死亡率高達第三位的惡性 腫瘤。大腸癌治療是以手術為主的積極綜合治療，手術治療可以切除原發灶，解除腫瘤造成 的梗阻癥狀。手術后化療近年來發展迅速，輔以免疫治療、中藥治療、基因靶向治療、特別是 靶向治療越來越多的用于臨床。大腸癌的發生是多階段、多步驟、涉及到多種癌基因及抑癌 基因激活或失活等復雜過程形成的。化療會提高晚期大腸癌的生存期，但一部分患者會出 現耐藥，一旦晚期大腸癌發生耐藥的不良事件，據文獻報道生存期不會超過半年。
[0003] 大腸癌的發生、發展是一個受多基因、多步驟調控的復雜過程，是基因突變致癌的 經典模式，此過程常與細胞增殖、凋亡失控有關，涉及癌基因（主要為Ras基因）、抑癌基因 (主要包括P53基因、APC基因等）、錯配修復基因（MMR基因）以及一些修飾基因（如C0X-2 等）。
[0004]KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF都是EGFR下游的信號分子，是眾多信號通路上關鍵的 激活因子。這些基因的突變常見于多種惡性腫瘤，在大腸癌患者中的突變率分別為20~ 50%、1 ~6%、10 ~30%、8 ~15%。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變一般會使結直腸 癌患者對抗EGFR抗體類藥物產生耐藥。因此，對大腸癌進行KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基 因遺傳變異的檢測至關重要，然而目前臨床上大多每次只能檢測一個突變或一段基因的突 變，檢測通量低，耗時長，尚無能夠同時、一次性完成對此4個基因突變進行檢測的試劑盒。
[0005] 因此以期待找到適合大腸癌靶向治療將提高晚期大腸癌的預后生存期、減少耐藥 不良事件的發生，為大腸癌的個體化治療提供新方案，使晚期大腸癌患者受益。基因突變的 聯合檢測能提高腫瘤臨床治療的針對性，降低治療費用，節省寶貴的治療時間
[0006] 本發明提供一種高靈敏度和高特異性的用于一次性檢測多重大腸癌突變基因的 引物、探針、試劑盒及引物分配方式。該檢測試劑盒利用DNA樣本進行基因突變的檢測， 提供突變狀態的定性評估，特異性和靈敏度高，檢測結果重復性好，而且引入了熒光檢測技 術，克服了傳統PCR產物遺留污染的問題，操作簡便快捷，可輔助臨床醫生篩選出可受益于 腫瘤靶向藥物的大腸癌等癌癥患者，為臨床腸癌基因突變的檢測提供了一種快速可靠的檢 測方法。該方法可以實現一次性檢測DNA的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因37種突變，大大 縮短了檢測的時間，為臨床醫生對結直腸癌患者選擇腫瘤靶向藥物治療提供參考。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種用于一次性檢測多重腸癌突變基因的引物、探針，包 括10^^1^、？11(304、81^等突變基因的引物、探針及分配方式，其序列如表1;
[0008] 表1腸癌突變特異性引物、新型探針及分配方式
【主權項】
1.用于檢測腸癌的引物和探針，包括如下61條序列，且所述的序列用12聯管分裝分組 如下：
2. -種用于檢測腸癌基因突變檢測的反應體系，包括：
3. -種試劑盒，包括權利要求1所述的序列。
【專利摘要】本發明公開了一次性檢測腸癌多重突變基因的引物、探針、檢測體系和試劑盒，其中包括用于檢測腸癌KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF基因突變的引物、探針及其分配方式。本發明的檢測試劑盒采用12聯PCR反應條設計，每一個12聯PCR條檢測一個樣品，12聯條的1-11管內裝有相應的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因37種突變檢測和內控試劑，突變由FAM信號指示，內控由HEX(或VIC)信號指示；12號管作為DNA提取質量的外控檢測管，亦由FAM信號指示。本發明可以實現一次性檢測DNA的KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因37種突變，大大縮短了檢測的時間，靈敏度高，特異性強，操作簡便快捷，可為臨床醫生對腸癌患者選擇腫瘤靶向藥物治療提供參考。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104818317
【申請號】CN201410213583
【發明人】江風閣, 林清華, 曹櫻, 陳婷, 宋慶濤, 阮力, 鄭立謀
【申請人】廈門艾德生物醫藥科技有限公司
【公開日】2015年8月5日
【申請日】2014年5月20日