基于lamp和分子信標檢測hpv16和18的反應體系和方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學檢測技術領域，更具體地，本發明涉及一種基于LAMP和分 子信標對16和18型人乳頭瘤病毒病原體進行檢測的反應體系及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌是威脅全球女性健康最嚴重的疾病，2008年全球新發宮頸癌病例52. 98 萬，死亡病例25. 51萬人，其中85%新發病例在發展中國家。高危型人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses, HPV)的持續感染是引起宮頸癌及其癌前病變的主要原因。宮頸癌患者 100%攜帶高危型HPV感染，高度病變（CIN2或CIN3)患者中約97%為HPV陽性，低度病變 (CINl)中的陽性率也達 61. 4%。常見的高危型 HPV 有：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59、68、73、82 等。
[0003] 目前的HPV檢測平臺包括傳統的PCR產物凝膠電泳、定量PCR、反向膜雜交、基因芯 片、液相芯片等，但這些技術多局限于具備PCR操作資質的三甲醫院檢驗科或疾病控制中 心進行，收費昂貴，不利于對人群進行廣泛篩查。
[0004] 環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 Notomi于2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區 域設計4-6條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在等溫條件 (60-65°C左右）下放置30-60分鐘，即可完成核酸擴增反應。作為一種簡單、快速、成本低、 特異性強的檢測技術，已在食品安全、微生物檢驗、臨床診斷等方面得到了廣泛應用。專利 申請號201110242077. 6即提供了一種基于LAMP技術檢測HPV常見亞型的檢測方法。
[0005] LAMP技術應用于臨床的最大問題在于：傳統LAMP技術多采用觀測焦磷酸鎂白色 沉淀、HNB染料顏色、鈣黃綠素熒光等方法判斷陽性，但上述方法的陽性檢測結果只能代表 實驗過程中發生了 LAMP反應過程，而無法區分真正的由引物和對應目標DNA模版雜交而形 成的陽性擴增結果和由于引物之間、引物與樣本DNA之間誤雜交發生誤擴增所導致的假陽 性結果，對臨床檢測造成了不便。
[0006] 分子信標（molecular beacon)是1996年Tyagi等發明的一種有莖環結構的焚光 探針。當沒有靶序列存在時，分子信標探針低溫時自身閉合，熒光基團和淬滅基團相互靠近 而不發熒光。在有靶序列存在的情況下，分子信標低溫時與互補的靶序列形成穩定的雙鏈 雜交體，使熒光基團和淬滅基團分離，發出熒光，隨著溫度的升高，雙鏈雜交體逐漸解鏈，達 到熔點時，熒光迅速下降。通過控制反應溫度同時觀測熒光值，即可判斷是否存在靶序列的 擴增。在PCR擴增的退火階段，分子信標與生成的靶序列結合發出熒光，在延伸階段，脫離 靶序列而不干擾擴增，隨著循環次數的增加，與模板結合的分子信標的量亦增加，最終的熒 光強度與擴增的模板量成正比。該技術具有極高的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別 是它可以進行實時定量檢測、甚至可以用于活體分析。
[0007] 綜上所述，亟需建立一種能夠快速、高特異性和靈敏性、同時檢測多種HPV病毒病 原體的技術。
【發明內容】
[0008] 基于此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種快速、高特異性和靈敏 性、基于LAMP和分子信標同時檢測HPV16和18的反應體系和檢測方法。
[0009] 為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：
[0010] 基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，所述反應體系包括檢測HPV16 和HPV18的引物組，
[0011] 所述檢測HPV16的引物組為：
[0012] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的外引物F3 ;
[0013] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示的外引物B3 ;
[0014] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示的內引物FIP ;
[0015] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的內引物BIP ;
[0016] 分子信標探針MB-16 ;
[0017] 所述檢測HPV18的引物組為：
[0018] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示的外引物F3 ;
[0019] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示的外引物B3 ;
[0020] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 8所示的內引物FIP ;
[0021] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 9所示的內引物BIP ;
[0022] 分子信標探針MB-18 ;
[0023] 所述反應體系包括以下組分：
【主權項】
1. 一種基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，其特征在于，所述反應體系 包括檢測HPV16和HPV18的引物組， 所述檢測HPV16的引物組為： 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的外引物F3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示的外引物B3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示的內引物FIP ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的內引物BIP ; 分子信標探針MB-16 ; 所述檢測HPV18的引物組為： 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示的外引物F3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示的外引物B3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 8所示的內引物FIP ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 9所示的內引物BIP ; 分子信標探針MB-18 ; 所述反應體系包括以下組分：
2. 根據權利要求1所述的基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，其特征 在于，所述反應體系包括以下組分：
3. 根據權利要求1或2所述的基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，其 特征在于，所述反應緩沖液（2X)包括以下組分：
4. 根據權利要求1或2所述的基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，其 特征在于，所述分子信標探針MB-16的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，所述分子信標探針 MB-18的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 10所示。
5. 根據權利要求4所述的基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，其特征 在于，所述分子信標探針MB-16的核苷酸序列的5'端連接有熒光染料FAM，3'端連接有熒 光猝滅基團BHQ1。
6. 根據權利要求4所述的基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系，其特征 在于，所述分子信標探針MB-18的核苷酸序列的5'端連接有熒光染料R0X，3'端連接有熒 光猝滅基團BHQ2。
7. -種基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 、采用Axygen公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測樣品的DNA ; (2) 、將待測樣品的DNA加入到權利要求1-6任一項所述的反應體系中，56-65°C下，反 應30-90分鐘進行LAMP反應； (3)、LAMP反應后，分別于4°C、65°C和95°C用紫外燈照射，觀察熒光。
8.根據權利要求7所述的基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的方法，其特征在于， 步驟（2)中所述LAMP反應的反應條件為：60°C下，反應60分鐘。
【專利摘要】本發明公開了一種基于LAMP和分子信標檢測HPV16和18的反應體系和方法，所述反應體系包括檢測HPV16和HPV18的外引物F3、B3、和內引物FIP、BIP、和分子信標探針MB-16、MB-18。本發明的檢測HPV16和18的方法基于LAMP和分子信標技術檢測HPV病原體，該方法在傳統LAMP技術的基礎上利用分子信標探針在不同溫度下發出熒光強度的差異對LAMP擴增產物進行檢測，與傳統的LAMP技術相比，本發明可避免傳統LAMP技術因為引物自身雜交所造成的假陽性結果，具有特異性強，操作簡單的優點。
【IPC分類】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70
【公開號】CN104805218
【申請號】CN201510154708
【發明人】鐘田雨, 黃劭
【申請人】贛南醫學院第一附屬醫院, 江西賢聚景欣醫藥生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月2日