酶法生產乳果糖的制作方法
【專利說明】
[0001](一)
技術領域
本發明涉及乳果糖，具體涉及酶法生產乳果糖。
[0002](二)
【背景技術】
乳果糖口服溶液英文名稱:Lactulose Oral Solut1n漢語拼音:RuguotangKoufurongye,本品主要成份為乳果糖。化學名稱:4_0_ β-D-卩比喃半乳糖基-D-果糖。性狀為淡棕黃色澄明黏稠液體。有降低血氨及緩瀉作用，主要用于治療氨性肝昏迷、高血氨癥及習慣性便秘等病癥。
[0003]國內外研宄人員將乳果糖生產的研宄重點集中于不同催化劑的使用和分離方法的開發，CN1093410采用加熱溶解乳糖，然后保持沸騰，滴加堿溶液，反應結束后調節pH至4-4.5，脫色，采用陰、陽離子交換樹脂脫鹽，然后真空濃縮、冷卻結晶可制得乳果糖漿。但是，產物得率低、工序復雜，成本高仍是化學法乳果糖制備中有待解決的問題。與之相比，酶法乳果糖制備可以避免產物降解和有色副產物生成等問題，目前國內外的研宄尚處在起步階段。因此，開發可以進行酶法轉化制備乳果糖的乳糖酶及其微生物生產菌種具有一定的經濟效益和社會效益。
[0004]2011年08月31，公布的一種節桿菌突變株、利用該突變株生產乳糖酶的方法及用乳糖酶制備乳果糖的方法中，公開了一種節桿菌突變株，該菌株分類命名為Arthrobactersp.jnsb-2，目前該菌株保藏于武漢中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，登記入冊的編號是CCTCC M 209210，保藏日期是:2009年9月27日。
[0005]該菌株具有下述性質:
1、形態特征:菌株在乳糖酵母膏蛋白胨固體培養基上生長良好，菌落為淡黃色，電子顯微鏡下顯示細胞為桿狀，兩端鈍圓。
[0006]2、生理生化特性:
(I)培養溫度:在20-37°C。最適溫度為30°C。
[0007](2)明膠液化淀粉水解:陽性。
[0008](3)革藍氏:陽性。
[0009](4)乳糖發酵:陽性。
[0010](5) H2S 生成:陰性。
[0011]3、16S rDNA序列分析:長度1383bp，序列與GenBank中的節桿菌屬16SrDNA 具有較高的同源性，其中與 Arthrobacter sp.CDB 1、Arthrobacter sp.AGL 5、Arthrobactersp.2-12的相似性為99%。上述方案反應條件溫和，沒有有色副產物生成，操作方便，但是其產物純度及反應時間仍有待提高。
[0012](三)
【發明內容】
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種酶法生產乳果糖，操作方便，過程易于控制，反應時間短，產物純度高，有利于工業化生產。
[0013]本發明是通過如下技術方案實現的:
一種酶法生產乳果糖，其特殊之處在于:包括以下步驟: (1)節菌突變株生產乳糖酶:將節桿菌突變株經固體斜面活化、種子培養后再進行發酵培養，其中，
發酵培養的培養基:碳源可選用葡萄糖、乳糖或甘油中的任一種，其質量體積比濃度為1% -2% ;氮源可選用酵母膏、蛋白胨或玉米漿中的一種或多種，其質量體積比濃度為0.5-12% ;無機鹽可選用氯化鈣、Zn2+、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或氯化鐵中的一種或多種，其濃度為12-28mmol/L，其濃度為；發酵培養的條件為:25_30°C培養；將生成的發酵液經5000-6000rpm離心得到菌體，隨后經破碎細胞、10000-12000rpm離心取上清液即為酶液；
(2)底物溶液的配制:用pH5.5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為300g/L，果糖濃度為250g/L ；
(3)水解和轉苷反應
向底物溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+ 1mmoI/L，氯化鐵4-6 mmol/L在20_25°C反應0.5-1.5h，進行水解和轉苷反應，得到酶解液；
(4)酶解液的后處理
向酶解液中加入無水乙醇，使其終濃度為65-70%，經離心后取上清液經60-65°C加熱濃縮后處理即可制得乳果糖漿。
[0014]本發明的有益效果:本發明用于生產乳果糖操作簡單、作用條件溫和、易掌握，沒有有色副產物生成，產物純度高，易純化。菌株培養條件粗放，產酶周期短，操作方便，大大提高了酶法生產乳果糖的產量，是發酵工藝中的重大的創新，值得推廣。
[0015](四)【具體實施方式】實施例1
本發明的節桿菌突變株Arthrobacter sp.jnsb_2可應用于發酵生產乳糖酶，具體如下:
(I)培養基的配制
固體培養基:蛋白胨I%、酵母提取物0.5%、NaCll%，pH 7.0，瓊脂2%，121°C滅菌20min。種子培養基:蛋白胨I %、酵母提取物0.5%、NaCll%，pH 7.0，121°C滅菌20min。
[0016]發酵培養基:乳糖2%，酵母膏 1.4 %，氯化1? 0.5mmol/L Zn2+1 Ommo I/L，FeCl3L Smmol /T,, pH7.0，121°C滅菌 20min。
[0017](2)菌種發酵培養
將節桿菌突變株Arthrobacter sp.jnsb-2固體斜面活化2h，然后接一環此菌至種子培養基，30°C恒溫培養lh，搖瓶轉速200r/min。將上述種子菌懸液以10% (v/v)接種至發酵培養基，25°C恒溫培養lh，搖瓶轉速200r/min。
[0018](3)將發酵液以5000rpm離心1min收集細胞，用同體積磷酸緩沖液(10mmol/L，pH7.0)重懸，經超聲波破碎細胞，12000rpm，離心lOmin，取上清即為酶液。
[0019]利用本實施的經節桿菌突變株生產得到的乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為:
(I)底物溶液的配制
用PH5.5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為300g/L，果糖濃度為 250g/L ；
(2)水解和轉苷反應向步驟(I)的溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+ 10mmol/L，氯化鐵4 mmol/L，在20°C反應1.5h，進行水解和轉苷反應，得到酶解液；
(3)酶解液的后處理
向步驟(2)中得到的酶解液中加入無水乙醇，使其終濃度為65%，12000rpm，離心lOmin，上清液經60°C加熱濃縮。經檢測，乳果糖含量為94.1%。
[0020]實施例2
與實施例1基本相同，其不同之處在于:
步驟(I)中所用發酵培養基為葡萄糖1%，玉米漿2.5%，氯化鈣0.5!1111101/1，Zn2+10mmol/L , FeCl3 1.5mmo 1/L ;步驟(2)中接種后的發酵培養條件為:25°C恒溫培養0.8h，搖瓶轉速 200r/min。
[0021]步驟(3)中發酵液以5000rpm離心15min收集細胞，用同體積磷酸緩沖液(10mmol/L，pH7.0)重懸，經超聲波破碎細胞，lOOOOrpm，離心15min，取上清即為酶液。
[0022]利用本發明的經節桿菌突變株生產得到的乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為:
(1)底物溶液的配制
用pH5.5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為300g/L，果糖濃度為 250g/L ；
(2)水解和轉苷反應
向步驟(I)的溶液中加入600U/L乳糖酶，在25°C反應lh，進行水解和轉苷反應，得到酶解液；
(3)酶解液的后處理
向步驟(2)中得到的酶解液中加入無水乙醇，使其終濃度為70%，12000rpm，離心lOmin，上清液經60°C加熱濃縮。經檢測，乳果糖含量為93.7%。
[0023]實施例3
與實施例1基本相同，不同之處在于:發酵培養基為甘油0.2%，蛋白胨1%，酵母膏 0.5%,KH2P0415mmol/L,MgS04.7H20 2.5mmol/L，氯化鈣0.5mmol/L，Zn2+10mmol/L ;步驟
(2)中接種后的發酵培養條件為:
25°C恒溫培養1.5h，搖瓶轉速200r/min。
[0024]利用本發明的經節桿菌突變株生產得到的乳糖酶作為催化劑催化乳糖和果糖合成乳果糖的方法，具體為:
(1)底物溶液的配制
用pH 5.5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為300g/L，果糖濃度為 250g/L ；
(2)水解和轉苷反應
向步驟(I)的溶液中加入600U/L乳糖酶，在25°C反應1.5h，進行水解和轉苷反應，得到酶解液；
(3)酶解液的后處理
向步驟(2)中得到的酶解液中加入無水乙醇，使其終濃度為70%，12000rpm，離心lOmin，上清液經65°C加熱濃縮。經檢測，乳果糖含量為90.7%。
[0025] Zn2+可以為 ZnS04、ZnCl2。
【主權項】
1.一種酶法生產乳果糖，其特征在于:包括以下步驟: (1)節菌突變株生產乳糖酶:將節桿菌突變株經固體斜面活化、種子培養后再進行發酵培養，其中， 發酵培養的培養基:碳源可選用葡萄糖、乳糖或甘油中的任一種，其質量體積比濃度為1% -2% ;氮源可選用酵母膏、蛋白胨或玉米漿中的一種或多種，其質量體積比濃度為0.5-12% ;無機鹽可選用氯化鈣、Zn2+、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或氯化鐵中的一種或多種，其濃度為12-28mmol/L，其濃度為；發酵培養的條件為:25_30°C培養；將生成的發酵液經5000-6000rpm離心得到菌體，隨后經破碎細胞、10000-12000rpm離心取上清液即為酶液； (2)底物溶液的配制:用pH5.5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為300g/L，果糖濃度為250g/L ； (3)水解和轉苷反應 向底物溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+ 1mmoI/L，氯化鐵4-6 mmol/L在20_25°C反應0.5-1.5h，進行水解和轉苷反應，得到酶解液； (4)酶解液的后處理 向酶解液中加入無水乙醇，使其終濃度為65-70%，經離心后取上清液經60-65°C加熱濃縮后處理即可制得乳果糖漿。
【專利摘要】本發明涉及一種酶法生產乳果糖，包括以下步驟：節菌突變株生產乳糖酶；用pH5.5-8.0的磷酸緩沖液配制乳糖和果糖溶液，其中乳糖濃度為300g/L，果糖濃度為250g/L；向底物溶液中加入600U/L乳糖酶，Zn2+10mmol/L，氯化鐵4-6mmol/L在20-25℃反應0.5-1.5h，進行水解和轉苷反應，得到酶解液；向酶解液中加入無水乙醇，經離心即可制得乳果糖漿。本發明用于生產乳果糖操作簡單、作用條件溫和、易掌握，沒有有色副產物生成，產物純度高，易純化。菌株培養條件粗放，產酶周期短，操作方便，大大提高了酶法生產乳果糖的產量，是發酵工藝中的重大的創新，值得推廣。
【IPC分類】C12P19-14, C12R1-06, C12P19-12
【公開號】CN104805152
【申請號】CN201410726572
【發明人】竇寶德, 張繼紅, 竇光朋
【申請人】山東百龍創園生物科技有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年12月4日