一種從花椒內生耐寒短桿菌發酵液中制備l-酪氨酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種從花椒內生耐寒短桿菌發酵液中制備L-酪氨酸的方法。
[0002] 本發明得到的菌株已于2013年9月14日在中國典型培養物保藏中心保藏，編 號：CCTCC M 2013422,分類名稱耐寒短桿菌屬GH-HJZ2 (Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2)〇
【背景技術】
[0003] L-酪氨酸是一種芳香族氨基酸，屬于條件必須氨基酸，適量補充酪氨酸可刺激 大腦神經，改善記憶力，還可輔助改善焦慮、煩躁等情緒，增強身體抵抗力。此外，L-酪 氨酸還是合成L-多巴和黑色素的主要原料，L-多巴是臨床上治療帕金森氏病的常用藥 物。傳統的L-酪氨酸合成法是采用酸、堿或酶對含蛋白質的原料進行水解，但隨著環境 問題的出現及資源的短缺，許多學者開始關注通過微生物發酵來制備L-酪氨酸（Hagino H, Nakayama K. L-Tyrosine production by analogresistant mutants derived from a phenylalanine auxotroph of Corynebacterium glutamicum[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1973, 39:2013-2023. Ito H, Sakurai S, Tanaka T. Genetic breeding of L-tyrosine producer Brevibacterium lactofermentum[J]. Agricultural and Biological Chemistry. 1990. 54:699-705)。本發明人研宄發現，花椒內生耐寒短桿菌 屬Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2 (保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編 號為：CCTCC M2013422)液體發酵產物經S印hadex LH-20層析柱初步分離，高效液相色譜 (HPLC)分析后，對發酵產物進行進一步的分離純化，并采用電噴霧電離質譜（ESI-MS)及核 磁共振（NMR)等方法鑒定出發酵產物中含有L-酪氨酸。
[0004] 目前，未見從花椒內生耐寒短桿菌發酵產物中分離制備L-酪氨酸的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種從花椒內生耐寒短桿菌發酵液中制備L-酪氨酸的方 法。
[0006] 本發明的目的由以下技術措施實現：
[0007] 從花椒內生耐寒短桿菌發酵液中制備L-酪氨酸的方法包括以下步驟：
[0008] (1)微生物菌種及培養基
[0009] 菌種：由中國典型培養物保藏中心保藏的一株花椒內生耐寒短桿菌屬 GH-HJZ2(fcevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2,保藏編號為：CCTCC M2013422)菌 株，培養條件為劃線接種到斜面培養基上，于溫度30°C恒溫培養箱中培養24h后，將獲得的 菌落接種一個單菌落到150mL發酵培養基中，在溫度28~37°C下，120~180r/min的水浴 恒溫振蕩器上振蕩培養24~72h。
[0010] 耐寒短桿菌斜面培養基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，蒸餾水 lOOOmL，初始 pH 值 7· 2 ~7· 4。
[0011] 發酵培養基為：1 %可溶性淀粉，3. 5%黃豆粉，I % NaCl，初始pH值7.0。
[0012] ⑵發酵生產
[0013] 用上述菌種及培養方法將花椒內生耐寒短桿菌屬GH-HJZ2 (Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2,保藏編號為：CCTCC M2013422)發酵獲得發酵液。
[0014] (3)發酵產物預處理
[0015] 將上述發酵液用低速離心機在常溫下以4000~6000r/min的速度離心15min后 除去菌體，然后收集上清液，真空冷凍干燥后備用；
[0016] (4) Sephadex LH-20 柱分離
[0017] 將上述發酵液過Sephadex LH-20層析柱，按樣品與Sephadex LH-20質量比 1:20~50的比例上樣，上樣量為柱體積的20% ;用IOOmL純水進行等梯度洗脫，洗脫流速 為2~6mL/min ;按每份收集量20mL等份收集洗脫液，編號Ft F 5備用；
[0018] (5)物質純化
[0019] 將組分F3用制備型液相色譜儀（pre-HPLC)進行分離純化，條件如下：GL-science 色譜柱（20 X 250mm，5 μ m)，流速18. 9mL/min，柱溫25°C，紫外檢測波長280nm，進樣量2mL， 20%甲醇溶液洗脫30min，收集保留時間為3. 8min的色譜峰，冷凍干燥即得L-酪氨酸，得率 為8~15mg/L，其結構式如下：
[0020]
【主權項】
1. 一種從花椒內生耐寒短桿菌發酵液中制備L-酪氨酸的方法，其特征在于該方法包 括以下步驟： (1) 微生物菌種及培養基 菌種：由中國典型培養物保藏中心保藏的一株花椒內生耐寒短桿菌屬 GH-HJZ2(fcevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2,保藏編號為：CCTCC M2013422)菌 株，培養條件為劃線接種到斜面培養基上，于溫度30°C恒溫培養箱中培養24h后，將獲得的 菌落接種一個單菌落到150mL發酵培養基中，在溫度28~37°C下，120~180r/min的水浴 恒溫振蕩器上振蕩培養24~72h ; 其中，耐寒短桿菌斜面培養基為：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，蒸餾水 1000mL，初始 pH 值 7. 2 ~7. 4 ; 發酵培養基為：1 %可溶性淀粉，3. 5 %黃豆粉，1 % NaCl，初始pH值7. 0 ; (2) 發酵生產 用上述菌種及培養方法將花椒內生耐寒短桿菌屬GH-HJZ2 (Brevibacterium frigoritolerans GH-HJZ2,保藏編號為：CCTCC M2013422)發酵獲得發酵液； (3) 發酵產物預處理 將上述發酵液用低速離心機在常溫下以4000~6000r/min的速度離心15min后除去 菌體，然后收集上清液，真空冷凍干燥后備用； (4) Sephadex LH-20 柱分離 將上述發酵液過Sephadex LH-20層析柱，按樣品與Sephadex LH-20質量比1:20~50 的比例上樣，上樣量為柱體積的20%;用100mL純水進行等梯度洗脫，洗脫流速為2~6mL/ min ;按每份收集量20mL等份收集洗脫液，編號Ft F 5備用； (5) 物質純化 將組分F3用制備型液相色譜儀（pre-HPLC)進行分離純化，條件如下：GL-science色譜 柱（20 X 250mm，5 y m)，流速 18. 9mL/min，柱溫 25°C，紫外檢測波長 280nm，進樣量 2mL，20% 甲醇溶液洗脫30min，收集保留時間為3. 8min的色譜峰，冷凍干燥即得L-酪氨酸，得率為 8~15mg/L，其結構式如下：
【專利摘要】本發明公開了一種從花椒內生耐寒短桿菌發酵液中制備L-酪氨酸的方法，其特點是將花椒內生耐寒短桿菌于溫度30℃恒溫培養活化24h后，接種到發酵培養基中，于溫度28～37℃，120～180r/min水浴中恒溫振蕩發酵培養24～72h；將發酵液在常溫下以4000～6000r/min的速度離心15min后除去菌體獲得上清液冷凍干燥；按樣品與Sephadex LH-20質量比1:20～50且上樣量為柱體積的20％將發酵液過Sephadex LH-20層析柱，用100mL純水等度洗脫，按每份收集量20mL等份收集洗脫液F1～F5；將組分F3用制備型液相色譜儀進行分離純化，冷凍干燥即得到L-酪氨酸，得率為8～15mg/L發酵液。CCTCC M201342220130914
【IPC分類】C12R1-13, C12P13-22
【公開號】CN104805146
【申請號】CN201410706579
【發明人】鐘凱, 陳沖, 鄧鵬翅, 李霄潔, 趙志峰, 高鴻, 山口五十磨
【申請人】四川大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年11月27日