一種基于gs篩選系統的動物細胞高效表達載體及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于GS篩選系統的動物細胞高效表達 載體及應用。
【背景技術】
[0002] 伴隨著細胞培養技術的進步，特別是在哺乳動物細胞培養的發展，提高了單克隆 抗體和其他重組蛋白的表達量。在哺乳動物細胞中表達重組蛋白需要一個漫長的過程，涉 及到目的基因轉染到細胞的克隆的選擇，適應不同的培養條件下(通常為懸浮液和無血清 培養基)，在生物反應器中培養和規模化工業水平。事實上，由于單克隆抗體和其他重組蛋 白的高需求，需要建立了大規模生產的過程，以滿足市場的需求。然而在提高重組蛋白表達 量涉及很多方面，其中攜帶目的蛋白載體是一個十分關鍵環節，而且載體上啟動子和篩選 標志是兩個至關重要部分。對于常用的重組蛋白的表達，在哺乳動物細胞中，強烈的病毒啟 動子/增強子或細胞的啟動子/增強子能夠明顯增強宿主細胞表達水平。最廣泛使用的兩 個啟動子是來自于猿猴病毒40 (SV40)和巨細胞病毒（CMV)。穩定轉染的標記基因通常與 目的基因的轉染宿主細胞，賦予選擇優勢。最常用的標記基因為二氫葉酸還原酶（DHFR)基 因和谷氨酰胺合成酶（GS)基因。DHFR表達系統是通過使用氨甲蝶呤（MTX，amethopterin) 給藥加壓，而GS表達系統是通過蛋氨酸亞氨基代砜（MTS, methionine sulphoximine)加 壓。
[0003] 傳統加壓方式，常常會出現使篩選標志基因被大量擴增，而目的蛋白很少擴增。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種構建表達載體的方法。
[0005] 本發明提供的方法，包括如下步驟：將出發載體pIRSE-EGFP-B的驅動目的基因表 達的CMV啟動子替換為hCMV啟動子，且在所述出發載體pIRSE-EGFP-B中插入標記基因，得 到表達載體。
[0006] 上述方法中，包括如下步驟：將所述標記基因插入所述出發載體PIRSE-EGFP-B的 多克隆位點后，得到中間載體，再將所述中間載體的驅動目的基因表達的CMV啟動子替換 為hCMV啟動子，得到表達載體。在本發明的實施例中，多克隆位點為Ase I和Nhe I，中間 載體pHGS為將GS標記基因插入pIRSE-EGFP-B的Ase I和Nhe I酶切位點間得到的載體。 [0007] 上述方法中，所述標記基因為GS標記基因。
[0008] 上述方法中，所述GS標記基因的核苷酸序列為序列表中的序列3自5'末端第 12-1797位核苷酸；
[0009] 所述hCMV啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列3自5'末端第1806-3953位核 苷酸。
[0010] 上述方法中，所述出發載體pIRSE-EGFP-B為將pIRSE-EGFP載體的BamH I位點去 除的載體。
[0011] 上述方法中，所述出發載體pIRSE-EGFP-B按照包括如下步驟的方法制備：將載體 PIRES2-EGFP進行BamH I單酶切后再補平粘性末端得到出發載體pIRSE-EGFP-B ;
[0012] 所述出發載體pIRSE-EGFP-B的核苷酸序列具體為序列表中序列4.
[0013] 由上述的方法制備的表達載體也是本發明保護的范圍。
[0014] 上述表達載體的核苷酸序列為序列表中的序列3。
[0015] 上述的表達載體在提高目的蛋白表達中的應用也是本發明保護的范圍。
[0016] 上述的表達載體在篩選高效表達目的蛋白的細胞株中的應用也是本發明保護的 范圍。
[0017] 上述應用中，所述目的蛋白的編碼基因為序列表中的序列1或序列2所示的核苷 酸。
[0018] 本發明的實驗證明，本發明先將pIRSE-EGFP載體的BamH I位點突變得到載體 pIRSE-EGFP-B，在其基礎上將原有CMV啟動子替換為人hCMV啟動子，并增加了 GS標記基 因，得到高效表達載體。該高效表達載體在表達目的蛋白更有優勢，通過GS系統能夠快速 獲得高效表達細胞系。
[0019] 通過改造質粒在很過方面具有優勢：（1)它具備G418篩選標志；（2)具有GS篩選 標志；（3)同時它也具有EGFP基因表達，很方便挑單克隆；（4)大大縮短了獲得高效表達細 胞系所需要時間；（5)獲得1?效表達細胞系成功率也提1? ; (6)重組蛋白獲得量明顯提1? ; (7)節約了成本。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 為 GS PCR 擴增（M :200bp Marker)
[0021] 圖 2 為 Ase I /Nhe I 雙酶切片段電泳圖（M :200bp Marker)
[0022] 圖 3 為 hCMV PCR 擴增（M :200bpMarker)
[0023] 圖 4 為 Pac I /Nhe I 雙酶切片段電泳圖（M :200bpMarker)
[0024] 圖 5 為 IgG2PCR 擴增（I :igu/igd 引物，2 :IGF/IGR 引物，M :200bpMarker)
[0025] 圖6為細胞系免疫熒光下強度
[0026] 圖7為穩定細胞系的上清Wester Blot
[0027] 圖8為在不冋選著壓力下目標蛋白表達量
[0028] 圖9為細胞系在不同MSX濃度下蛋白表達量
[0029] 圖 10 為 pIRES2-EGFP-B 圖譜
[0030] 圖11為GS基因組成圖譜
[0031] 圖12為pHGS圖譜
[0032] 圖13為hCMV啟動子組成圖譜
[0033] 圖14為pHGSL 0質粒完整圖譜
【具體實施方式】
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0035] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0036] 部分材料和方法如下：
[0037] CHO-S細胞系購自Life technologies公司，產品目錄號為10743 ;
[0038] 大腸桿菌感受態TranslO、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒以及DNA Marker購自 北京天根科技有限公司；pIRES2-EGFP;pfu DNA聚合酶購自北京全式金公司；限制性內切 酶 Ase I、Nhe I、BamH I、Pac I、EcoR I、T4DNA 連接酶購自 NEB 公司；Invitrogen2000 月旨 質體購自Life公司；DMEM/F12購自GIBCO公司；胎牛血清為杭州四季青公司；免疫球蛋白 IgG定量試劑盒購自華科生物工程股份有限公司；G418購自INALCO公司；MTS購自Coring 公司；其他的試劑都為國產分析純試劑。引物合成和測序由英俊公司完成。
[0039] 根據已有載體及合成基因設計引物，如表1所示：
[0040] 表1為所需要引物
[0041]
【主權項】
1. 一種構建表達載體的方法，包括如下步驟：將出發載體pIRSE-EGFP-B的驅動目的基 因表達的CMV啟動子替換為hCMV啟動子，且在所述出發載體pIRSE-EGFP-B中插入標記基 因，得到表達載體。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：將所述標記基因 插入所述出發載體pIRSE-EGFP-B的多克隆位點后，得到中間載體，再將所述中間載體的驅 動目的基因表達的CMV啟動子替換為hCMV啟動子，得到表達載體。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述標記基因為GS標記基因。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于： 所述GS標記基因的核苷酸序列為序列表中的序列3自5'末端第12-1797位核苷酸； 所述hCMV啟動子的核苷酸序列為序列表中的序列3自5'末端第1806-3953位核苷 酸； 所述出發載體pIRSE-EGFP-B為將pIRSE-EGFP載體的BamH I位點去除的載體。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述出發載體pIRSE-EGFP-B按照包括如 下步驟的方法制備：將載體PIRES2-EGFP進行BamH I單酶切后再補平粘性末端得到出發載 體 pIRSE-EGFP-B ; 所述出發載體pIRSE-EGFP-B的核苷酸序列具體為序列表中序列4。
6. 由權利要求1-5中任一所述的方法制備的表達載體。
7. 根據權利要求6所述的表達載體，其特征在于：所述表達載體的核苷酸序列為序列 表中的序列3。
8. 權利要求6或7所述的表達載體在提高目的蛋白表達中的應用。
9. 權利要求6或7所述的表達載體在篩選高效表達目的蛋白的細胞株中的應用。
10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：所述目的蛋白的編碼基因為序列表 中的序列1或序列2所示的核苷酸。
【專利摘要】本發明公開了一種基于GS篩選系統的動物細胞高效表達載體及應用。本發明提供了一種構建表達載體的方法，包括如下步驟：將出發載體pIRSE-EGFP-B的驅動目的基因表達的CMV啟動子替換為hCMV啟動子，且在所述出發載體pIRSE-EGFP-B種插入標記基因，得到表達載體。本發明的實驗證明，本發明先將pIRSE-EGFP載體的BamHⅠ位點突變得到載體pIRSE-EGFP-B，在其基礎上將原有CMV啟動子替換為人hCMV啟動子，并增加了GS標記基因，得到高效表達載體。該高效表達載體在表達目的蛋白更有優勢，通過GS系統能夠快速獲得高效表達細胞系。
【IPC分類】C12N15-85, C12N15-65, C12N5-10
【公開號】CN104805107
【申請號】CN201410037976
【發明人】邵勇, 胡顯文, 高招剛, 高麗華, 潘蕓, 王友亮, 劉羽, 李伊培
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年1月26日