一種來自水稻的磷酸甘露糖異構酶基因OsPMI1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和植物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種來自 水稻（Oryza sativa)的磷酸甘露糖異構酶基因 OsPMIl的分離和克隆及應用。
【背景技術】
[0002] 轉基因技術，是20世紀80年代初發展起來的一種有效的植物定向改良方法。該 技術主要通過農桿菌介導、基因槍轉化等方法將目的基因導入受體，經過標記篩選和分子 檢測，獲得穩定表達的轉化體，實現目標性狀的快速定向改良，具有可用基因資源廣、改良 效率高等優點。轉基因技術為農作物的產量提升、品質改良和抗性增強提供了新路徑、開拓 了新空間。全球轉基因作物的研發和應用正步入快車道。由于轉基因作物的基因來源超越 了本物種的范圍，打破了原有物種生殖隔離的界限，轉基因技術的潛在安全風險也引起廣 泛關注。
[0003] 篩選標記基因的潛在安全風險是目前公眾對轉基因技術擔憂的一個重要方面。現 有轉基因技術，主要使用抗生素抗性基因作為篩選標記。抗生素標記基因與插入的目的基 因一起轉入目標作物中，用于幫助在植物遺傳轉化篩選和鑒定轉化的細胞、組織和再生植 株。標記基因本身并無安全性問題。但該類基因可能隨食物進入腸道，存在與腸道微生物 基因交換產生耐藥菌株的潛在風險，以致影響抗生素的醫用效果。為了替代抗生素抗性基 因，其他類型篩選標記基因被陸續研宄開發，如除草劑抗性基因、氨基酸代謝篩選基因、可 視標記基因等，但這些篩選標記基因要么存在類似問題，要么篩選效率和成本不適于規模 化應用。
[0004] 為避免對抗生素等傳統篩選劑的依賴，降低抗生素抗性基因等篩選標記的潛在風 險，近年來一些安全性更好的篩選標記基因應用于轉基因作物的研發，并取得了很好的效 果。如磷酸甘露糖異構酶（phosphate mannose isomerase，PMI)基因是一種糖代謝基因， 水稻等許多高等植物細胞雖能將甘露糖轉化為6-磷酸甘露糖，但由于細胞自身缺乏磷酸 甘露糖異構酶，或者表達量很低，不能進一步將6-磷酸甘露糖轉化為6-磷酸果糖，從而進 入糖酵解途徑而被利用。因此磷酸甘露糖異構酶可以作為篩選標記基因。而且與抗生素、 除草劑等負選擇不同，甘露糖是進行正選擇，轉化的細胞表達磷酸甘露糖異構酶，可以利用 甘露糖為碳源而正常生長，篩選效率較高。甘露糖廣泛存在于海藻、蕨類等植物中，同時PMI 的催化產物6-磷酸果糖是蜂蜜和果漿的主要成份，二者都是環境友好的天然物質。因此 PMI基因是一種安全篩選標記，有效避免了抗生素、除草劑等抗性基因存在的潛在風險。目 前，PMI篩選標記基因已在水稻、小麥、玉米、馬鈴薯等作物中得到成功應用，在開發安全性 較好的轉基因作物及其產品方面，具有廣泛的應用前景。
[0005] 但現在廣泛使用的磷酸甘露糖異構酶是從原核生物大腸桿菌中分離而來的，這是 因為目前人們還沒有意識到從原核生物大腸桿菌中分離出的磷酸甘露糖異構酶可能對轉 化受體基因組造成不利影響，還可能引發對其安全性的擔憂，或者是人們對這種從原核生 物大腸桿菌中分離出的PMI的安全性沒有引起足夠的重視。因此，本領域有對安全性更好 的高等植物源PMI篩選標記基因的迫切需求，但目前還沒有高等植物源的PMI篩選標記基 因的報道。
【發明內容】
[0006] 本申請的發明人基于在轉基因領域多年的研宄經驗，意識到從原核生物大腸桿菌 中分離出的磷酸甘露糖異構酶可能對轉化受體基因組造成不利影響，還可能引發對其安全 性的擔憂。針對目前來自大腸桿菌的PMI篩選標記所可能帶來的安全隱患，以及高度植物 源PMI篩選標記基因研宄較少的現狀，本發明希望獲得高等植物來源的磷酸甘露糖異構酶 基因，并以其為安全的篩選標記基因進行植物遺傳轉化。
[0007] 為了實現本發明的目的，發明人針對可能含有磷酸甘露糖異構酶基因的不同植 物，進行了大量植物提取實驗和酶活分析，并最終從水稻中成功分離、克隆了磷酸甘露糖異 構酶基因 OsPMIl，并以其作為篩選標記基因，成功獲得了轉基因植物。
[0008] 更具體而言，本申請的發明人從水稻（Oryza sativa)中分離、克隆了磷酸甘露糖 異構酶基因 OsPMIl。另外，本發明還構建了含有OsPMIl的原核表達載體，應用于OsPMIl蛋 白的酶活分析；構建了含有OsPMIl的植物表達載體，并以其作為篩選標記，應用于植物遺 傳轉化。
[0009] 具體而言，在第一個方面，本發明提供一種高等植物來源的磷酸甘露糖異構酶基 因，該磷酸甘露糖異構酶基因提取自水稻，本發明將其命名為OsPMIl。
[0010] 優選地，該磷酸甘露糖異構酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，SEQ ID N0:1 為：
[0011]
[0012]
【主權項】
1. 一種高等植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因OsPMIl，其特征在于，該磷酸甘露糖異 構酶基因OsPMIl分離、克隆自水稻。
2. 根據權利要求1所述的磷酸甘露糖異構酶基因OsPMIl，其特征在于，所述磷酸甘露 糖異構酶基因OsPMIl的核苷酸序列包含下述序列或者由下述序列構成： atggccggcc ctactcctcc tccgccggag gaggagccct cctccccttc cctgcgcctg 60 cgctgcgcgg tgcagcacta cgagtggggc cgacgcgggg aggcctccct cgtcgcccgc 120 ctctccgacg ccaacgccga cgaccacggc cccgaccccg cgcgccccta cgccgagctg 180 tggatgggca cgcacccctc cgcgccctcc tccctcctcg ccgacggcct cctcagggac 240 tggctcgcgc gccaccccgc cgcgctcggc cccgccgtcg ccgctcgctg gggaggcgac 300 ctcccattcc tcttcaaggt tctgtcggtg gccaaggcgc tgtcgatcca ggcgcacccg 360 gacaaggacc tcgccgaggt gctgcacgcg ctgcgtccgg ccacctacaa ggacggcaac 420 cacaagcccg agatggccat cgccgtcacc gagttccgcg tcctctgcgg ctttgccggt 480 atccaggaac ttaaggacgt tttaagaact gtgcctgaag ttgaagacct tgttggacct 540 gaagatgctg ccaagctttt gtctgtgaaa gagtaccatg gtgtcaatga agtaaaatcc 600 tgtctgcggt cagcttttac taagctaatg acagctagta aagaagcggt ttctgaagca 660 attacaaaat tgatttttcg cctgaatgct gagagcaagg taaggacctt aaccgagaaa 720 gaaaatctag ttttgtcgct ggagaaacaa tacccagaag atgttggtgt tctatcagca 780 tttttcttca attatatcaa gctcagtcct ggtgaagcac tttacattgg tgccaatgaa 840 ccacatgcat atctatccgg ggaatgcatt gaatgtatgg ccacttcaga taatgttgtt 900 cgtgctggtt tgacacccaa gtacagagat gtgcaaactc tttgctctat gctaacatac 9 60 aaacaggtct ttccagaaat cttgcggggg gttcctgtac agccgtatgt aagaaggtac 1020 acccctccgt ttgatgagtt cgaagttgac tgctgctcac taccaccagg cgaactggtt 1080 gtgatatccc cagtgtcagg tccatccgtc tacctagtga tggccgggga aggcgagatc 1140 caggtagatt ccatgccaaa tggtgaaaag tctaaacaag gtgatgtttt cttcgtgcca 1200 gcatacaccg aggttaagtt ctctgcctct ggtcctgagt gcatgcagct gtacagggct 1260 ggggtcaata gcagattctt caattaa 1287〇
3. -種原核表達載體，其特征在于，所述原核表達載體包含權利要求1或2所述的磷酸 甘露糖異構酶基因OsPMIl。
4. 一種用于鑒定所述磷酸甘露糖異構酶的酶活分析方法，其特征在于，所述鑒定方法 包括：利用兩步偶聯法對包含權利要求1所述的磷酸甘露糖異構酶基因的編碼蛋白或權利 要求3所述的原核表達載體的表達蛋白進行酶活分析。
5. -種表達盒，其特征在于，所述表達盒中包含權利要求1或2所述的磷酸甘露糖異構 酶基因OsPMIl。
6. -種植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體包含權利要求1或2所述的磷酸 甘露糖異構酶基因OsPMIl和/或權利要求5所述的表達盒。
7. -種利用含有權利要求1中所述的磷酸甘露糖異構酶基因OsPMIl的植物表達載體 獲得植物轉化細胞的方法，包括下述步驟： (1) 將植物種子去殼、滅菌后將胚分離出來，置于愈傷組織誘導培養基上以產生次級愈 傷組織； (2) 將所述次級愈傷組織轉移至新的愈傷組織誘導培養基進行預培養，獲得能夠用于 轉化的愈傷組織； (3) 將步驟（2)中獲得的愈傷組織與農桿菌接觸5-30分鐘，其中，所述農桿菌中引入了 所述植物表達載體，所述植物表達載體中攜帶所述的磷酸甘露糖異構酶基因OsPMIl ; (4) 將步驟（3)處理后的愈傷組織轉移到其上墊有無菌濾紙的培養皿中，在預定溫度 下培養24-72小時； (5) 將步驟（4)處理后的愈傷組織置于前篩選培養基上培養3-10天； (6) 將步驟（5)處理后的愈傷組織轉移至篩選培養基上，以獲得抗性愈傷組織，所述篩 選培養基中包含甘露糖，所述抗性愈傷組織為能夠代謝甘露糖的植物轉化細胞。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物為水稻，所述植物轉化細胞為水 稻轉化細胞。
9. 一種權利要求1或2所述磷酸甘露糖異構酶基因OsPMIl、權利要求5所述的表達 盒、權利要求6所述的植物表達載體的應用，其特征在于，所述應用包括利用所述磷酸甘露 糖異構酶基因OsPMIl作為篩選標記，基于權利要求7所述的方法獲得植物轉化細胞，并利 用所述植物轉化細胞獲得轉基因植物或植物部分。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述植物包括：糧食作物、蔬菜作物、花 丼作物、能源作物；所述植物部分包括：細胞、原生質體、細胞組織培養物、愈傷組織、細胞 塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉、根、根尖、花藥和種子。
【專利摘要】本發明提供了一種植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因OsPMI1，該磷酸甘露糖異構酶基因OsPMI1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發明還提供一種含有OsPMI1的原核表達載體。本發明還提供一種磷酸甘露糖異構酶的酶活分析方法。并且本發明提供一種含有OsPMI1的表達盒和一種植物表達載體，以及該表達盒和表達載體在植物遺傳轉化方面的應用。本發明利用OsPMI1基因構建的植物表達載體，以甘露糖為篩選劑，成功實現了轉化水稻細胞。本發明成功分離和克隆出植物來源的磷酸甘露糖異構酶基因，由于該磷酸甘露糖異構酶基因來源于植物(水稻)，對人類沒有潛在危險。可以用于替代來自大腸桿菌的磷酸甘露糖異構酶，從而降低潛在的安全風險。
【IPC分類】C12N15-82, A01H5-00, C12N9-90, C12N5-10, C12N15-61
【公開號】CN104805103
【申請號】CN201510160796
【發明人】魏鵬程, 楊劍波, 李莉, 楊亞春, 李娟 , 胡磊, 馬卉, 秦瑞英, 許蓉芳, 李 浩
【申請人】安徽省農業科學院水稻研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月7日